用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法，所述载体由质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列，该载体能够简便的将外源基因插入鸭疫里默氏杆菌基因组上，为研究细菌的蛋白定位提供了技术参考。

【技术实现步骤摘要】
用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法
本专利技术属于生物
，涉及用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，还涉及利用该载体在鸭疫里默氏杆菌基因组中插入外源基因的方法。
技术介绍
在细菌学研究中，功能蛋白的定位是研究蛋白功能的重要组成部分。目前所使用的方法为，通过基因工程的方法将目的蛋白的基因在大肠杆菌异源表达、纯化并通过免疫动物来制备抗目的蛋白的多克隆抗体。然后，提取细菌的各组成成份，如外膜蛋白、胞浆蛋白等，通过免疫印迹的方法来检测目的蛋白的定位。此种方法费时费力，且涉及动物试验不利于动物福利的提高。因此，急需一种既能提高试验的效率又能提高动物福利的方法来替代这种传统的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体；本专利技术的目的之二在于提供利用所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，所述载体由质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列。优选的，所述含高表达启动子的pheS突变基因由以下方法制得：以质粒pLMF03::pheS*作为模板，SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示序列为引物进行PCR扩增；所述质粒pLMF03::pheS*由如SEQIDNO.5所示序列连入穿梭质粒pLMF03而得。优选的，所述外源基因为标签蛋白血凝素肽基因。优选的，所述含有外源基因编码序列的重组基因序列的核苷酸如核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。2.利用所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法，包括如下步骤：将所述载体转化供体菌S17.1，然后通过接合转移的方法将载体转移至鸭疫里默氏杆菌野生株RAATCC11845中，涂在含有头孢西丁和卡那霉素的血平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，经扩大培养后涂板在含有p-cl-Phe的GCB平板上使其进行第二次同源重组，筛选阳性克隆，即外源基因插入鸭疫里默氏杆菌基因组。优选的，所述血平板上，头孢西丁和卡那霉素的浓度分别为1μg/ml和20μg/ml。优选的，所述扩大培养条件如下：将第一次同源重组的菌株在TSB培养基中37℃、180rpm摇菌过夜。本专利技术的有益效果在于：本专利技术用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，该载体中含有外源基因，如序列标签，可以简便高效的方法进行基因组上插入外源基因，如标签，后续可以用于鸭疫里默氏杆菌的蛋白定位研究。本专利技术与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：1.提供了一种在鸭疫里默氏杆菌基因组上插入标签的方法。2.具有生物普遍性，为研究其它细菌的蛋白定位提供了技术参考。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为扩增含有pheS基因的pheSup和pheSdown片段电泳图(1泳道表示pheSup片段，2泳道表示pheSdown片段，M表示Marker)。图2为含有pheS点突变基因(pheS*)的融合PCR电泳结果(图中1泳道为融合片段；M表示Marker)。图3为重组质粒pLMF03::pheS*鉴定结果如图(A：进行PCR鉴定结果，图中1泳道为重组质粒pLMF03::pheS*；B：双酶切鉴定，酶切位点为NcoI、SpeI；1泳道为双酶切重组质粒pLMF03::pheS*，2泳道为双酶切空载质粒pLMF03；3泳道为没有进行酶切的空载质粒pLMF03)。图4为菌株R.anatipestifepLMF03和R.anatipestifepLMF03::pheS*对p-Cl-Phe的敏感性鉴定结果(图中1号为R.anatipestiferpLMF03，2号为R.anatipestiferpLMF03::pheS*)。图5为质粒pOES具体构建过程。图6为质粒构建过程鉴定图(A：质粒pMM47.A用PstI内切酶进行酶切后的电泳图：1泳道为酶切后的pMM47.A；B：pOES的PCR鉴定结果，1泳道为pOES质粒，2泳道为pLMF03::pheS*质粒作为阳性对照，3泳道为阴性对照；C：pOES双酶切鉴定图：用SalI和XbaI双酶切质粒pOES，1泳道即为进行双酶切后的电泳图)。图7为RA0C_1912down和RA0C_1912up+RA0C_1912-HA电泳图(1泳道为下游扩增片段RA0C_1912down，2泳道为上游片段RA0C_1912up+RA0C_1912-HA)。图8为PCR的方法鉴定融合的片段与自杀质粒pOES连接情况(1泳道为分离的单克隆DH5αpOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down跑出的PCR条带，条带大小在1800bp左右)。图9为重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down，用XhoI和SpeI同时进行双酶切鉴定结果(1泳道为双酶切重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down)。图10为重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down转化至供体菌S17.1后PCR鉴定结果(1泳道为cfx基因扩增片段，2泳道为16SrDNA基因扩增片段)。图11为鉴定RA0C_1912插入HA-tag结果(A图为cfx的PCR鉴定图，1泳道为RAATCC为模板，2泳道RAATCCRA0C_1912-HA-tag为模板，3泳道为cfx阳性对照；B图为上游RA0C_1912up+RA0C_1912-HA的鉴定图，1泳道为RAATCC为模板，2泳道为RAATCCRA0C_1912-HA-tag为模板；C图为下游HA-tag+RA0C_1912down的鉴定图，1泳道为RAATCC为模板，2泳道为RAATCCRA0C_1912-HA-tag)。图12为HA-tag多克隆抗体进行Western-blot(1泳道为野生株RAATCC，2泳道为RAATCCRA0C_1912-HA-tag；A：用HA-tag多克隆抗体进行孵育的结果图，B：为对照组用内参蛋白RecA多克隆抗体进行孵育的结果)。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术利用鸭疫里默氏杆菌R.anatipestifeATCC基因组上的pheS基因的突变体作为一种反向筛选的标记，进而专利技术一种自杀载体并利用此自杀载体专利技术一种在基因组中的某个基因后面插入标签的方法。其原理是：PheS是苯丙氨酰基tRNA合酶的α-亚单位，PheS的301位丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)后，就会降低苯丙氨酰-tRNA合成酶的底物特异性，苯丙氨酸的卤化类似物对氯苯丙氨酸(p-cl-Phe)就会被苯丙氨酰-tRNA合成酶转运至细胞中，而p-cl-Phe对细胞有毒性作用会导致细胞死亡。因此在培养基中添加p-cl-Phe后，携带突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述载体由质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列。

【技术特征摘要】
1.用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述载体由质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列。2.根据权利要求1所述用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述含高表达启动子的pheS突变基因由以下方法制得：以质粒pLMF03::pheS*作为模板，SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示序列为引物进行PCR扩增；所述质粒pLMF03::pheS*由如SEQIDNO.5所示序列连入穿梭质粒pLMF03而得。3.根据权利要求1所述用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述外源基因为标签蛋白血凝素肽基因。4.根据权利要求1所述用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘马峰，黄月，刘珈均，程安春，汪铭书，朱德康，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51