一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法，涉及脂肪酸生产领域。通过构建提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒并转化获得重组蓝藻，该重组蓝藻过表达前脂蛋白二脂酰转移酶Lgt和硫酯酶AcTesA。前脂蛋白二脂酰转移酶Lgt是一种支架蛋白，在蓝藻膜导向序列的作用下定位于细胞膜。硫酯酶AcTesA通过柔性肽FL3与支架蛋白Lgt相连，硫酯酶蛋白AcTesA具有低底物特异性，可以水解C8－C16的酰基ACP，能获得种类丰富的脂肪酸产物。本发明专利技术通过支架蛋白Lgt将硫酯酶蛋白AcTesA的固定在细胞膜上，加快了蓝藻细胞中脂肪酸合成速度，降低了细胞中的ROS含量，最终提高了转基因突变株分泌至细胞外的脂肪酸产量。

A recombinant cyanobacteria with high expression of fatty acids and its preparation method

The invention discloses a recombinant cyanobacteria expressing fatty acids efficiently and a preparation method thereof, which relates to the field of fatty acid production. Recombinant cyanobacteria were obtained by constructing plasmids to increase the expression of fatty acids in cyanobacteria. The recombinant cyanobacteria overexpressed pre-lipoprotein diacyltransferase Lgt and thioesterase AcTesA. Lgt is a scaffold protein, which is located in the cell membrane under the guidance of cyanobacterial membrane sequence. Thioesterase AcTesA is linked to scaffold protein Lgt through flexible peptide FL3. Thioesterase protein AcTesA has low substrate specificity, can hydrolyze acyl ACP of C8-C16, and can obtain a variety of fatty acid products. The invention fixes the thioesterase protein AcTesA on the cell membrane by the scaffold protein Lgt, speeds up the fatty acid synthesis in cyanobacteria cells, reduces the ROS content in cells, and finally improves the fatty acid production secreted by the transgenic mutant strain to extracellular.

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻及其制备方法
本专利技术涉及一种重组蓝藻，尤其涉及其在提高蓝藻脂肪酸合成效率方面的作用及其制备方法。
技术介绍
能源，是整个人类社会发展的推动力，随着石油资源的紧缺以及环境的日亦恶化，对环保且可再生能源的需求变得越来越迫切，而生物燃料能很好地解决此问题。脂肪酸是合成生物燃料的重要前体，可以通过化学或生物合成将其进一步加工成脂肪醇、脂肪烃、脂肪酸甲酯等不同用途的化工材料和能源。目前为止，被用于生产脂肪酸的微生物主要是大肠杆菌和酵母，但天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂产量有限，且天然脂肪酸多为胞内分泌，必须从组织和细胞中分离才能得到，增加了生物燃料的制造成本。作为一种原始的单细胞原核生物，蓝藻广泛分布在不同的生境中，能利用太阳能进行产氧性光合作用。与植物和异养微生物相比，蓝藻具有光合转化效率高、生长速度快、不占用土地、遗传操作简便等优势，而且经过遗传改造的蓝藻能够将合成的燃料物质直接分泌出胞外，有助于降低工艺成本，因此在生物燃料开发领域具有广阔的应用前景。利用代谢工程和合成生物学手段对蓝藻脂肪酸代谢途径进行改造和调控以提高目的产物产量的工作有很多。研究人员用蓝藻模式菌株Synechocystissp.PCC6803作为宿主细胞，通过敲除内源酰基-ACP合成酶(AAS)，过表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，引入经密码子优化的大肠杆菌硫酯酶(TesA)，同时削弱细胞壁肽聚糖层的强度，将游离脂肪酸产量提高到了197mg/L。在另一种脂肪酸耐受的蓝藻模式菌株Synechococcussp.PCC7002中，研究人员也通过敲除酰基-ACP合成酶(AAS)和长链脂肪酸辅酶A连接酶(FadD)，以及过表达大肠杆菌硫酯酶TesA和来源于SynechococcuselongatusPCC7942的RuBisCO基因，最终合成了130mg/L的游离脂肪酸。在专利技术专利“一种脂肪酸产量提高的重组蓝藻、其制备方法及其应用”中，专利技术人通过在Synechocystissp.PCC6803中过表达乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)，将重组蓝藻的总脂肪酸含量相较于野生型藻株提高了47.93％。但是，要想达到工业生产的需求，目前用蓝藻来生产脂肪酸的效率还远远不够，需要更有效的方法对脂肪酸代谢途径进行改造，以获得理想的产物合成效率。在构建脂肪酸合成工程菌的过程中，研究人员不仅要解决在不影响宿主细胞体内代谢流平衡的前提下最大限度地提高脂肪酸生物合成途径的效率的问题，同时还要面对工程菌对于其自身代谢终产物耐受性不足的挑战。研究表明，蓝藻对脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸具有较高的敏感性，不饱和酸可能通过与活性氧簇(Reactiveoxygenspecies，ROS)反应产生一些毒性物质，如过氧化氢物或自由基，这些物质会通过插入细胞或细胞器膜对细胞生理活动产生影响。有研究显示，ROS的产生和胞内游离脂肪酸的含量密切相关，因此对脂肪酸的耐受性不足是限制工程化蓝藻的经济稳定性的重要因素之一。另外，由于很多工程菌都会被敲除酰基－ACP合成酶(AAS)来阻断脂肪酸的再循环途径，因此进一步加剧了脂肪酸在胞内的堆积，给细胞生长造成巨大的压力。不少研究工作通过削弱细胞外膜强度和过表达脂肪酸外排泵系统来促进积聚在胞内的游离脂肪酸外排，进而提升胞外游离脂肪酸的产量，但是类似的改造会对细胞产生生长抑制效应，造成细胞的提早凋亡，因此现有技术并不利于构建稳定的脂肪酸合成工厂。因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的重组蓝藻，该重组蓝藻具有促进胞内合成的脂肪酸的外排，增加胞外脂肪酸产量，也进一步提高工程化蓝藻对自身合成脂肪酸产物的耐受性。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是现阶段蓝藻生产脂肪酸的效率偏低，同时工程化蓝藻对自身合成脂肪酸的耐受性交叉，无法达到工业化生产的需求。本专利技术的一个方面提供了一种提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，所述质粒包括蓝藻膜导向序列、编码前脂蛋白二脂酰转移酶的Lgt基因和编码硫酯酶的基因，所述Lgt基因来源于集胞藻Synechocystissp.PCC6803，所述蓝藻膜导向序列用于将前脂蛋白二脂酰转移酶定位于细胞膜上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因顺序串联在一个表达盒上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因的表达位于同一启动子的控制之下。进一步地，所述编码硫酯酶的基因为AcTesA基因，来源于不动杆菌Acinetobacterbaylyi的硫酯酶AcTesA。在微生物合成脂肪酸的过程中，有一类叫做硫酯酶的蛋白发挥着重要作用。硫酯酶可以催化水解脂酰基ACP生成游离脂肪酸和ACP，解除由脂酰ACP导致的脂肪酸生物合成调节机制中的反馈抑制作用，释放游离脂肪酸。而且不同来源的硫酯酶具有不同的底物特异性，因此可以产生不同碳链长度的脂肪酸产物，从而提高产物的多样性。分离自不动杆菌Acinetobacterbaylyi的硫酯酶AcTesA具有低底物特异性，可以水解C8－C16的酰基ACP，获得种类丰富的脂肪酸产物，避免了在底盘细胞中同时表达多个硫脂酶的复杂性。进一步地，所述Lgt基因的蛋白序列如SEQIDNO:1所示；AcTesA基因编码的蛋白序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，所述Lgt基因的基因序列为SEQIDNO:3；AcTesA基因的基因序列如SEQIDNO:4。进一步地，所述Lgt基因和AcTesA基因之间通过柔性肽FL3的编码序列相连，柔性肽FL3的编码序列如SEQNO:5所示。进一步的，所述蓝藻膜导向序列优选为蓝藻蛋白转运系统Sec途径相关基因的信号序列ssSec，其基因序列如SEQIDNO:6所示。进一步地，所述启动子优选为为光敏启动子PcpcB，其基因序列为SEQIDNO:7。进一步地，所述提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒以pBluescriptIIKS(+)(Stratagene，货号：212207)为原始载体，最终质粒命名为PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII。原始载体中的U0168序列和D0168序列作为同源臂将需要表达的基因定向整合到蓝藻基因组中，U0168序列为SEQIDNO:8，D0168序列为SEQIDNO:9。本专利技术的另一个方面还提供了一种高效表达脂肪酸的重组蓝藻，所述重组蓝藻由前述提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒转化得到，其中Lgt蛋白和硫酯酶在蓝藻中同时过表达。优选的，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。进一步地，所述重组蓝藻为mAcT。本专利技术的再一个方面提供一种制备上述重组蓝藻的方法，所述方法包括：将额外拷贝的编码所述前脂蛋白二酯酰转移酶(Lgt)的基因和编码所述硫酯酶(AcTesA)的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。更具体地，本专利技术提供一种提高蓝藻胞外脂肪酸产量和提高蓝藻对脂肪酸耐受性的方法，其步骤如下：1)PCR克隆相关基因PcpcB，ssSec，Lgt和AcTesA，Lgt和AcTesA之间用柔性肽FL3连接，AcTesA的3’端带有His-tag。将各基因片段按顺序依次连接到载体pBluescriptIIKS(+)中，形成载体PcpcBssSecLgtAcTesA-nptII。卡那霉素抗性基因n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，其特征在于，所述质粒包括蓝藻膜导向序列、编码前脂蛋白二脂酰转移酶的Lgt基因和编码硫酯酶的基因；所述Lgt基因来源于集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803，所述蓝藻膜导向序列用于将前脂蛋白二脂酰转移酶定位于细胞膜上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因顺序串联在一个表达盒上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因的表达位于同一启动子的控制之下。

【技术特征摘要】
1.一种提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，其特征在于，所述质粒包括蓝藻膜导向序列、编码前脂蛋白二脂酰转移酶的Lgt基因和编码硫酯酶的基因；所述Lgt基因来源于集胞藻Synechocystissp.PCC6803，所述蓝藻膜导向序列用于将前脂蛋白二脂酰转移酶定位于细胞膜上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因顺序串联在一个表达盒上，所述Lgt基因和编码硫酯酶的基因的表达位于同一启动子的控制之下。2.如权利要求1所述的提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，其特征在于，所述编码硫酯酶的基因为AcTesA基因，来源于不动杆菌Acinetobacterbaylyi的硫酯酶AcTesA。3.如权利要求2所述的提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，其特征在于，所述Lgt基因编码的蛋白序列如SEQIDNO:1所示；所述AcTesA基因编码的蛋白序列如SEQIDNO:2所示。4.如权利要求3所述的提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，其特征在于，所述Lgt基因和AcTesA基因之间通过柔性肽FL3的编码序列相连。5.如权利要求4所述的提高蓝藻脂肪酸表达量的质粒，其特征在于，所述蓝藻膜导...

【专利技术属性】
技术研发人员：马钢，莎加·阿夫林，王毓舒，贺林，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31