一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体、重组菌株及其制备方法、应用技术

本发明专利技术涉及一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体、重组菌株及其制备方法、应用，属于生物技术领域。本发明专利技术在构建重组质粒pNZ8110Δsp‑napA时，将pNZ8110中分泌信号序列去掉，因此本发明专利技术中表达的NapA分子中不携带分泌信号肽，分子量为15KD，避免了重组菌株在分泌表达蛋白失败时，因信号肽无法在菌体中切除而对NapA生物活性造成的不利影响。本发明专利技术提供的表达幽门螺杆菌NapA的乳酸乳球菌重组菌株不仅可用于制造免疫调节性药品，而且可用于生产具有免疫调节功效的保健食品，对食品过敏、免疫抑制和肿瘤等疾病防治具有重要意义，可产生可观的社会和经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体、重组菌株及其制备方法、应用
一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体、重组菌株及其制备方法、应用，属于生物

技术介绍
目前研究表明，一些过敏性疾病、感染和肿瘤与免疫功能失调有关[SchwartzJS,TajudeenBA,CohenNA.Medicalmanagementofchronicrhinosinusitis-areviewoftraditionalandnovelmedicaltherapies.ExpertOpinInvestigDrugs.2017Oct；26(10):1123-1130.//WoodwardJ,Gkrania-KlotsasE,KumararatneD.Chronicnorovirusinfectionandcommonvariableimmunodeficiency.ClinExpImmunol.2017Jun；188(3):363-370.]。而治疗这些免疫功能相关性疾病，常缺乏特效的免疫调节剂。新型免疫调节剂的研究对提高这些疾病的防治技术具有重要意义[GernezY,Nowak-WegrzynA.ImmunotherapyforFoodAllergy:AreWeThereYet？JAllergyClinImmunolPract.2017Mar-Apr；5(2):250-272.//KobernickAK,BurksAW.Activetreatmentforfoodallergy.AllergolInt.2016Oct；65(4):388-395.//LiQ,PrinceME,MoyerJS.Immunotherapyforheadandnecksquamouscellcarcinoma.OralOncol.2015Apr；51(4):299-304.]。对于食品过敏等免疫失调性疾病，口服免疫调节剂的研制以其用药途径安全、方便、合理等优点而具有发展前景，但限于免疫调控机制的复杂性、胃肠道内的特殊微环境和现有技术水平，目前口服免疫调节剂的研制尚多处于探索阶段[Brotons-CantoA,Martín-ArbellaN,GamazoC,IracheJM.Newpharmaceuticalapproachesforthetreatmentoffoodallergies.ExpertOpinDrugDeliv.2016Oct27:1-12.//ZécriFJ.FromNaturalProducttotheFirstOralTreatmentforMultipleSclerosis:TheDiscoveryofFTY720(GilenyaTM)？CurrOpinChemBiol.2016Jun；32:60-6.]。由于胃肠道中消化液对生物制剂的降解作用，为提高口服生物制剂的免疫效果，常需要借助细菌载体递送免疫活性蛋白[DavittCJ,LavelleEC.Deliverystrategiestoenhanceoralvaccinationagainstentericinfections.AdvDrugDelivRev.2015Aug30；91:52-69.]。幽门螺杆菌NapA是一种毒力因子，可通过与胃黏膜上皮细胞表面的碳氢化合物结合介导菌体对胃壁的粘附，也可吸引和激活中性粒细胞[PolenghiA,BossiF.Theneutrophil-activatingproteinofHelicobacterpyloricrossendotheliatopmmoteneutrophiladhesioninvivo.JImmunol,2007,178(3):1312-1320.]。据报道，NapA对细胞DNA具有双重作用：一方面，可通过刺激活性氧产生而损伤DNA；另一方面，又可通过其亚铁氧酶中心(ferroxidasecenter)对DNA产生保护作用[YokoyamaH,FujiiS.Structuresandmetal-bindingpropertiesofHelicobacterpylorineutrophil-activatingproteinwithadi-nuclearferroxidasecenter.Biomolecules,2014,4(3):600-615.]。研究发现，幽门螺杆菌NapA与黏膜免疫佐剂联合经口免疫实验动物，能产生抗幽门螺杆菌感染的效果；另有研究通过体外细胞培养实验发现幽门螺杆菌NapA具有促进Th2免疫反应向Th1型免疫反应转化的功能[SatinB,DelGiudiceG,DellaBiancaV,etal.Theneutrophil-activatingprotein(HP-NAP)ofHelicobacterpyloriisaprotectiveantigenandamajorvirulencefactor.JExpMed,2000,191(9):1467-1476.]。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级的益生菌，其安全性十分可靠[MorelloE,Bermúdez-HumaránLG,LlullD,etal.Lactococcuslactis,anefficientcellfactoryforrecombinantproteinproductionandsecretion.JMolMicrobiolBiotechnol,2008,14(1-3):48-58.//WangM,GaoZ,ZhangY,PanL.Lacticacidbacteriaasmucosaldeliveryvehicles:arealistictherapeuticoption.ApplMicrobiolBiotechnol.2016Jul；100(13):5691-701.]；而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有作为口服疫苗载体的很大潜力[StentzR,BongaertsRJ,GunningAP,GassonM,ShearmanC.ControlledreleaseofproteinfromviableLactococcuslactiscells.ApplEnvironMicrobiol,2010,76(9):3026-3031.]。目前，乳酸乳球菌NICE表达系统在安全性方面具有明显优势[MierauI,KleerebezemM.10yearsofthenisin-controlledgeneexpressionsystem(NICE)inLactococcuslactis.ApplMicrobiolBiotechnol,2005,68(6):705-17.]。《幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白在乳酸菌中的表达及免疫活性》作者彭晓燕等，公开了一种利用乳酸乳球菌系统表达NapA蛋白的方法，具体为：将PCR扩增出的napA基因片段连接入市售表达载体pNZ8110中的NaeI和SphI之间即得到，但是该种方法制得的表达载体表达出的NapA蛋白分泌失败，只出现在菌体内，而且携带着分泌信号肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体，其特征在于：在敲除掉SP功能区域的表达载体pNZ8110的Pnis启动子和Terminator终止子之间插入有napA基因片段。

【技术特征摘要】
1.一种表达幽门螺杆菌NapA蛋白的重组载体，其特征在于：在敲除掉SP功能区域的表达载体pNZ8110的Pnis启动子和Terminator终止子之间插入有napA基因片段。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述的napA基因片段为如SEQIDNO.1中第210-644位所示的基因片段或者与其相似性达95％的基因片段。3.如权利要求1所述的重组载体的制备方法，其特征在于：包括：PCR扩增出幽门螺杆菌的napA基因片段，将napA基因片段连接入已敲除掉SP功能区域的表达载体pNZ8110的NcoI酶切位点和SphI酶切位点之间，筛选、鉴定，即得。4.包含如权利要求1所述的重组载体的重组菌株。5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株由...

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣光，段广才，彭晓燕，王辉，王琛，余飞燕，牛志国，梁文娟，陈帅印，范清堂，张凌寒，张卫东，杨海燕，郗园林，
申请(专利权)人：新乡医学院，郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41