一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法技术

本发明专利技术涉及生物能源技术领域，公开了一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法。本发明专利技术选择适宜希瓦氏菌的启动子与外源电子载体flavins基因连接，使希瓦氏产生更多flavins，提高MFC电化学性能，同时结合突变菌株和孔蛋白oprF基因，可进一步提高生物膜形成和促进flavins在希瓦氏体内的进出，提高电子传递速率，更好的传递电子。更进一步，本发明专利技术使用了具有生物兼容性的氧化石墨烯(GO)，能与希瓦氏菌自组装成三维多层生物膜，进一步大大提高了生物膜的厚度和阳极生物载量，操作简便快捷，而且有效的提高了MFC电化学性能。

【技术实现步骤摘要】
一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法
本专利技术涉及生物能源
，更具体的说是涉及一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法。
技术介绍
能源短缺和环境污染是我国现今面临的日益严峻的问题，因而能源开发和环境废物治理及过程中能源可再生利用成为了我国现代社会进行可持续发展的一大挑战。科学家们不断寻找新的技术解决方案，其中微生物燃料电池(MicrobialFuelCell,MFC)就是其中之一用来产生可替代能源和环境废物治理新装置，并且其重要性现今日益显现。MFC是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着MFC的功能及应用，希瓦氏菌属是目前发现的广泛用于MFC中产电的微生物之一，其代谢路径和胞外电子传递路径研究的比较明确。希瓦氏菌的电子传递主要分为两方面，一是DET(直接电子转移)调节，即电子通过细胞膜上细胞色素直接传递给电极。在DET方面，主要是通过增加生物膜的形成来提高EET(胞外电子转移)效率。如，KaiM.Thormann等人通过改造mxd基因簇和第二信使c-di-GMP增加了三维生物膜的形成，从而增强MFC效率；除了自然生物膜的形成，XingXie等人用石墨烯-海绵-不锈钢等材质设计了阳极电极，也高效的增加了MFC效率……通过修饰阳极材料增加阳极菌体载量能有效的提高人工生物膜形成，然而这些阳极修饰材料制作时有些繁琐而且耗时。二是MET(间接电子转移)调节，即通过分泌可溶性电子载体flavins(黄素，包括黄素单核苷酸FMN和核黄素RF)传递电子。Flavin浓度的高低在希瓦氏菌MET传递中起着重要的作用，SharonB.Velasquez-Orta等人往MFC中添加直接添加微摩尔浓度的FMN和RF，电压和功率明显增加；YunYang等人在希瓦氏菌中导入了枯草芽孢杆菌的flavin合成路径，功率密度也有很大的提高；DiMin等人过表达了西瓦菌产flavin的基因簇和外膜细胞色素，也明显增加了MFC效率。但是，这些方法效率仍然不高，而且希瓦氏菌内可利用的启动子比较少，并且没有形成系统化的研究成果。目前希瓦氏菌改造没有大肠杆菌技术那么成熟，很多改造方法还是比较局限，因此研究或发展一些能在希瓦氏菌里有效工作的生物方法或生物组件对希瓦氏菌后续改造和研究非常重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组质粒，使其在应用于希瓦氏菌的改造中能够提高其MFC电化学性能；本专利技术的另外一个目的在于提供一种转化有上述重组质粒的重组希瓦氏菌，使其具备较高的MFC电化学性能；本专利技术的另外一个目的在于提供一种借助所述重组希瓦氏菌的MFC产电方法，使其具备较高的MFC电化学性能。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种重组质粒，在基础载体质粒上连接含有至少一个启动子，以及来源于枯草芽孢杆菌的ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因组成的基因表达元件；所述五个flavin合成基因均包含RBS基因，优选为RBS1基因(SEQIDNO:1所示)，所述启动子独立选自Ptac(SEQIDNO:2所示)和Ptet(SEQIDNO:3所示)，ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的序列依次如SEQIDNO:4-8所示。本专利技术从选择适宜希瓦氏菌的启动子，然后与flavins路径连接并嵌入到载体质粒上，使转化了所述重组质粒的希瓦氏产生能够产生更多的flavins，从而提高MFC产电效率。其中，所述基础质粒载体为PYYD质粒载体，其质粒图谱参见图1，质粒序列如SEQIDNO:9所示。在本专利技术具体实施方式中，以PYYD质粒为基础载体，所述基因表达元件连接到XbaI、SpeI酶切位点之间。作为优选，所述基因表达元件中的至少一个启动子与ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因直接连接。依据生物领域基因表达元件的一般原则，启动子位于各表达基因的5’端，根据启动子的个数，可以将启动子选择性的连接到ribA、ribD、ribE、ribH、ribC的5’端，相对于一个启动子，多个启动子更能够保证基因表达元件的顺利表达。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术提供了如下直接连接形式的基因表达元件：启动子+ribA+ribD+启动子+ribE+ribH+ribC除上述连接形式之外，本专利技术还包括根据上述连接形式衍生出的多种表达原件连接形式，如调整启动子个数和/或启动子位置，以及各flavins合成基因的先后顺序等等。为了促进flavins在希瓦氏体内的进出，更好的传递电子，提高电子传递速率，从而进一步提高MFC效率。本专利技术在前述方案基础上，所述基因表达元件还包括含有RBS序列的孔蛋白OprF基因，OprF孔蛋白是一个外膜蛋白，过多的表达会对细胞有一定的毒性。RBS是细胞翻译起始的有效控制因子之一，是细菌翻译的限速步骤，RBS影响翻译起始速率可以用热力学原理计算表征，本专利技术利用此优化RBS基因序列，选RBS2基因与OprF连接，OprF序列如SEQIDNO:10所示，RBS2序列如SEQIDNO:11所示。该基因可插入到任何flavins合成基因前或后，直接连接；例如，所述基因表达元件为启动子+ribA+ribD+启动子+ribE+ribH+ribC+OprF顺次连接而成。与其他常规的flavin基因表达元件相比，本专利技术所构建的重组质粒中的基因表达元件更适合于希瓦氏菌，并具备较高flavins浓度的有益效果，这为提高MFC产电效率提供了基础。基于此，本专利技术提供了所述重组质粒在构建重组希瓦氏菌中的应用。依据应用，本专利技术还提供了一种重组的希瓦氏菌，其转化有本专利技术所述重组质粒。在本专利技术具体实施方式中，所述希瓦氏菌可以是希瓦氏菌MR-1或本专利技术提供的一种经过诱变获得的希瓦氏菌，其保藏编号为CGMCCNo.15432。同时，本专利技术还根据提供的重组希瓦氏菌，提供了一种MFC产电的方法，包括：步骤1、活化所述重组的希瓦氏菌；步骤2、将所述重组的希瓦氏菌倒入阳极液中采用双室MFC产电。试验证明，利用本专利技术所述重组的希瓦氏菌进行MFC产电，MFC功率密度可高达1.12W/m2，是目前已有报道中希瓦氏菌单菌改造MFC效果最高的。为了进一步提高MFC产电效率，本专利技术进一步往MFC中添加了水溶性GO(氧化石墨烯)，GO被希瓦氏菌还原成rGO(还原石墨烯),并与细菌和flavins自组装形成细菌-flavins-rGO三维自组装生物膜，rGO具有很好的生物兼容性和导电性，并且能够吸附小分子物质。这样形成了三维自组装细菌-flavins-rGO多层生物膜，flavins吸附在rGO上同时增强了π-π相互作用，加强了传递电子的能力。其功率密度可上升到2.63W/m2，是关于希瓦氏菌的MFC中效果最优的。此外，如果本专利技术双室MFC中的阳极采用体积电极(如碳刷，修饰的海绵，修饰的碳泡沫等等)而不是本专利技术具体实施例中的二维碳布电极，将会进一步大大增强MFC效率。在具体的双室MFC产电中，本专利技术可使用本领域常规的阳极液和阴极液进行产电，在本专利技术具体实施方式中，可使用如下阳极液和阴极液：所述阳极液由M9缓冲液、18mM乳酸钠、5％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，在基础载体质粒上连接含有至少一个启动子，以及来源于枯草芽孢杆菌的ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因组成的基因表达元件；所述五个flavins合成基因均包含RBS序列，所述启动子独立选自Ptac和Ptet。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，在基础载体质粒上连接含有至少一个启动子，以及来源于枯草芽孢杆菌的ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因组成的基因表达元件；所述五个flavins合成基因均包含RBS序列，所述启动子独立选自Ptac和Ptet。2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述基础质粒载体为PYYD质粒载体。3.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述基因表达元件中的至少一个启动子与ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因直接连接。4.根据权利要求3所述重组质粒，其特征在于，所述基因表达元件为启动子+ribA+ribD+启动子+ribE+ribH+ribC顺次连接而成。5.根据权利要求1、3或4所述重组质粒，其特征在于，所述基因表达元件还包括含有RBS序列的孔蛋白OprF基因。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩，林童，王磊，曹英秀，
申请(专利权)人：天津大学，海南大学，
类型：发明
国别省市：天津,12