一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒技术

本发明专利技术涉及基因荧光定量检测技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒核酸提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒。该磁珠由连接有靶核苷酸序列的三种磁珠组成；本发明专利技术提取试剂包括所述磁珠；本发明专利技术试剂盒使用本发明专利技术的提取试剂。本发明专利技术磁珠通过在磁珠表面连接靶核苷酸序列，提高磁珠对乙型肝炎病毒核酸提取的特异性和灵敏性。本发明专利技术提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法，利用本发明专利技术的磁珠，并且在提取过程中通过升温和降温结合的方式，进一步提升对乙型肝炎病毒核酸提取的特异性和灵敏性。本发明专利技术乙型肝炎病毒定量检测用试剂盒，采用了由本发明专利技术磁珠组成的提取试剂，提高对乙型肝炎病毒检测的特异性和灵敏度，明显优于国内其他试剂盒。

Magnetic bead for extracting hepatitis B virus nucleic acid, extraction reagent, extraction method and quantitative detection kit

The invention relates to the technical field of gene fluorescence quantitative detection, in particular to a hepatitis B virus nucleic acid extraction reagent, a extraction method and a quantitative detection kit. The magnetic bead is composed of three magnetic beads connected with a target nucleotide sequence; the extraction reagent comprises the magnetic beads; the inventive kit uses the extraction reagent of the present invention. The magnetic bead of the invention improves the specificity and sensitivity of the magnetic bead to the hepatitis B virus nucleic acid extraction by connecting the target nucleotide sequence on the surface of the magnetic bead. Extraction method of hepatitis B virus nucleic acid extraction of the invention, the invention uses magnetic beads, and the heating and cooling methods in the extraction process, to further enhance the extraction of hepatitis B virus nucleic acid specificity and sensitivity. Use the kit for quantitative detection of hepatitis B virus, the extraction reagent consisting of the invention of magnetic beads, to improve the detection of hepatitis B virus specificity and sensitivity, significantly better than the other domestic kit.

【技术实现步骤摘要】
一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒
本专利技术涉及基因荧光定量检测
，具体涉及一种乙型肝炎病毒核酸提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)可以引起肝脏炎性病变和多器官损害，是严重危害人类健康的流行性病毒之一。人感染HBV后，病毒持续未被清除者可能发展为慢性肝炎，如果不进行适当的干预，约15％-40％的慢性HBV感染者最终将发生肝硬化，终末期肝病及肝癌，HBV感染者应积极进行抗病毒治疗，并监测其病毒载量变化。因此，乙型肝炎病毒核酸高灵敏度的定量检测对临床诊断治疗合理用药和判断预后具有重要意义。乙型肝炎病毒的基因组DNA是环状部分双螺旋的结构，长约3.2kb。两条DNA链不等长，其中2/3为双螺旋结构，1/3为单链。长链的5’端与3’端无共价连接，而是与一种蛋白质共价相连。长链的5’端以250-300对碱基互补结合。长链为负链，短链为正链。短链的长度视病毒而异，一般长约1.6-2.8kb，约为长链的2/3。短链之间的空隙可由病毒颗粒中的DNA聚合酶充填。乙肝病毒是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒。因而HBV的基因组结构显得特别精密浓缩，充分利用其遗传物质。HBV可分为A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型，且不同基因型致病性不同，我国属HBV感染高流行区，一般人群的HBsAg阳性率为9.09％。目前对于乙型肝炎病毒快速检测的方法主要由免疫学方法、基因芯片方法和核酸分子生物学方法。免疫学检测方法主要是检测乙型肝炎病毒感染过程中产生的抗原抗体免疫标志物，最常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，是将特异性抗原或抗体吸附于固相载体上，使其与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体,再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。基因芯片技术是将大量特定的寡核昔酸或基因片段作为探针，有规律地和高密度地排列，固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等，然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原则杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度，再经计算机分析处理数据从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上，在PCR扩增乙型肝炎病毒分型区域时应用荧光标记的dNRP即使产物带有荧光，通过将PCR产物与乙型肝炎病毒芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定。可用于乙型肝炎病毒的基因变异、基因分型的检测。核酸生物学方法是带有标记物的DNA或RNA片段即核酸探针能与互补的核酸序列特异结合。核酸探针的标记可用核素以及非放射性物质如生物素、地高辛等。乙型肝炎病毒的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较强。然而ELISA特异性强，但ELISA检测HbsAg为阴性的样品也可能乙型肝炎病毒DNA为阳性。基因芯片技术具有自动化程度高、灵敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点，但也存在成本高、假阳性率偏高、重复性差等缺陷。因此，目前此类试剂盒普遍存在成本高、假阳性率偏高、重复性差，特异性灵敏度低，不利于自动化等缺点。近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，基因检测技术已经广泛的应用于临床，这得益于其高度的灵敏性。DNA检测是重要的用药指征，尤其是抗病毒治疗，其可信值要高于包括免疫法在内的其它方法。因此，研发更加可靠稳定的基因诊断试剂盒对临床的指导意义显得更加突出。DNA的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。血清中病毒核酸的提取，目前主要有三种方法，煮沸法，柱提取法和磁分离方法，而磁分离法具有减少病毒损失，定量准确，操作简便，效率高，容易实现自动化等优点，已广泛应用于核酸的分离与纯化。不过，提取所用试剂价格昂贵，从而限制了它的广泛应用。临床上HBV-DNA定量检测的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR技术，其利用荧光定量PCR扩增仪，通过荧光检测装置能够检测荧光信号的动态变化，实时反映PCR的每个循环的扩增水平，同时通过其自身携带的软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与阈值的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断检测结果。目前国内外已有多种HBV-DNA定量检测试剂盒，此类试剂盒均基于实时荧光定量PCR技术，其在临床检测中的广泛应用突出暴露了很多问题，国外试剂盒购买成本高昂，严重限制了它的广泛的应用；而国内的多种此类试剂盒均表现出灵敏度不高，特异性不强，提取过程核酸损失严重等一些问题。另外，PCR扩增产物中高浓度的目标分子会以气溶胶的形式污染整个实验空间，都需要严格对PCR扩增产物进行后处理，由于PCR的高度灵敏性，甚至可以检测出反应体系中10个拷贝的模板浓度，从而可能给今后的实验带来严重的假阳性。因此，迫切需要提高HBV-DNA定量检测试剂盒的灵敏度和特异性。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种高特异性、高灵敏度提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠。本专利技术的目的之二是提供一种高特性性、高灵敏度提取乙型肝炎病毒核酸用提取试剂。本专利技术的目的之三是提供一种高特异性、高灵敏度提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法。本专利技术的目的之四是提供一种高特异性、高灵敏度定量检测乙型肝炎病毒的试剂盒。为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠，由磁珠一、磁珠二和磁珠三按照6：6：1比例混合组成；所述磁珠一为连接有靶核苷酸序列一的磁珠，磁珠二为连接有靶核苷酸序列二的磁珠，磁珠三为连接有靶核苷酸序列三的磁珠；所述靶核苷酸序列一为5’-Biotin-AGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTT-3’；靶核苷酸序列二为5’-Biotin-GAGACCTTCGTCTGCGAGGCGAGGGAGTT-3’；靶核苷酸序列三为5’-Biotin-C12-ATCGAGGGTAATCATTAACGGTGT-3’。一种提取乙型肝炎病毒核酸用提取试剂，由溶液1、溶液2、溶液3和溶液4组成；其中溶液1由0.1mol/L的EDTA-Na2溶液、2mol/L的NaOH溶液、6mol/L的盐酸胍溶液、质量浓度为20％的吐温溶液按照8：8：40：21的体积比混合组成；溶液2由4mol/L的HCl溶液与浓度为2.5ug/ul的磁珠溶液按照32：1.3的体积比混合组成；所述磁珠为上述磁珠；溶液3由0.1mol/L的EDTA-Na2溶液、4mol/L的NaCl溶液、1mol/L的Tris-HCl缓冲液与水按照0.25：0.625：0.25：49的体积比混合组成；溶液4由溶液3与质量浓度为20％的吐温按照20：1的体积比混合组成。一种提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法，包括以下操作步骤：1)将待测样本加入离心管中，然后取上述提取试剂中的溶液1加入离心管中，振荡混匀，瞬时离心；2)取上述提取试剂中的溶液2加入离心管中，振荡混匀后，50℃温度下加热10分钟后，瞬时离心，室温冷却2分钟；3)将步骤2)处理后的离心管放置在磁力架上收集磁珠10分钟，弃上清，加入上述提取试剂中的溶液4，振荡混匀，瞬时离心；5)将步骤3)处理后的离心管放置在磁力架上收集磁珠10分钟，弃上清，加入上述提取试剂中的溶液3，静置1分钟后，弃上清，即完成。一种乙型肝炎病毒定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠，其特征在于，由磁珠一、磁珠二和磁珠三按照6：6：1比例混合组成；所述磁珠一为连接有靶核苷酸序列一的磁珠，磁珠二为连接有靶核苷酸序列二的磁珠，磁珠三为连接有靶核苷酸序列三的磁珠；所述靶核苷酸序列一为5’‑Biotin‑AGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTT‑3’；靶核苷酸序列二为5’‑Biotin‑GAGACCTTCGTCTGCGAGGCGAGGGAGTT‑3’；靶核苷酸序列三为5’‑Biotin‑C12‑ATCGAGGGTAATCATTAACGGTGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠，其特征在于，由磁珠一、磁珠二和磁珠三按照6：6：1比例混合组成；所述磁珠一为连接有靶核苷酸序列一的磁珠，磁珠二为连接有靶核苷酸序列二的磁珠，磁珠三为连接有靶核苷酸序列三的磁珠；所述靶核苷酸序列一为5’-Biotin-AGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTT-3’；靶核苷酸序列二为5’-Biotin-GAGACCTTCGTCTGCGAGGCGAGGGAGTT-3’；靶核苷酸序列三为5’-Biotin-C12-ATCGAGGGTAATCATTAACGGTGT-3’。2.一种提取乙型肝炎病毒核酸用提取试剂，其特征在于，由溶液1、溶液2、溶液3和溶液4组成；其中溶液1由0.1mol/L的EDTA-Na2溶液、2mol/L的NaOH溶液、6mol/L的盐酸胍溶液、质量浓度为20％的吐温溶液按照8：8：40：21的体积比混合组成；溶液2由4mol/L的HCl溶液与浓度为2.5ug/ul的磁珠溶液按照32：1.3的体积比混合组成；所述磁珠为如权利要求1所述的磁珠；溶液3由0.1mol/L的EDTA-Na2溶液、4mol/L的NaCl溶液、1mol/L的Tris-HCl缓冲液与水按照0.25：0.625：0.25：49的体积比混合组成；溶液4由溶液3与质量浓度为20％的吐温按照20：1的体积比混合组成。3.一种提取乙型肝炎病毒核酸的提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1)将待测样本加入离心管中，然后取权利要求2所述的提取试剂中的溶液1加入离心管中，振荡混匀，瞬时离心；2)取权利要求2所述的提取试剂中的溶液2加入离心管中，振荡混匀后，50℃温度下加热10分钟后，瞬时离心，室温冷却2分钟；3)将步骤2)处理后的离心管放置在磁力架上收集磁珠10分钟，弃上清，加入权利要求2所述的提取试剂中的溶液4，振荡混匀，瞬时离心；5)将步骤3)处理后的离心管放置在磁力架上收集磁珠10分钟，弃上清，加入权利要求2所述的提取试剂中的溶液3，静置1分钟后，弃上清，即完成。4.一种乙型肝炎病毒定量检测用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的提取试剂、PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品和标准品。5.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒定量检测用试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液由以下溶液混合组成：10×PCR反应用缓冲液、2mmol/LdNTPs、质量浓度为50％的二甲基亚砜溶液、4mol/L甜菜碱溶液、30pmol/ul靶核苷酸引物混合液、30pmol/ul靶核苷酸探针溶液、30pmol/ul内标引物混合液、30pmol/ul内标探针溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建民，霍玉奇，杨昭杰，李广明，贾庆梅，李沛祥，李园园，赵花，岳汉军，
申请(专利权)人：郑州市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：河南,41