一种核酸提取磁珠的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种核酸提取磁珠的制备方法，是将磁性纳米Fe3O4颗粒的表面包被一层硅羟基再分散到万分之二的NaN3水溶液中；制得的硅基磁珠为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，SiO2外壳层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；硅基磁珠经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm~1μm，饱和磁化强度为43.0～74.5emu/g；制得的硅基磁珠应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、种子、全血、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。本发明专利技术的工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产。

【技术实现步骤摘要】
—种核酸提取磁珠的制备方法及应用
本方面属于磁性材料制备
，特别是涉及一种核酸提取磁珠的制备方法及应用。
技术介绍
磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体，可分散于基液中形成磁性液体材料，生物活性基团可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点。磁珠在外磁场的作用下可以定向移动和集中，撤去外磁场后，又可以恢复原来的结构与状态，从而使复杂的液固分离技术变得快捷简便。通过简单的洗脱即可得到纯度很高的靶向物质。目前，磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。对于核酸提取技术而言，磁珠法具有常规提取方法无法比拟的独特优势，诸如提取和纯化一步完成，定量提取，实现提取自动化，对于初学者而言操作简便。纳米Fe3O4由于其制备简单、稳定性高、较强的超顺磁性、生物相容性和表面易于修饰等特点，成为目前应用最广泛的磁珠材料之一。但是，由于纳米Fe3O4的小尺寸效应、磁偶极子引力等作用，磁性纳米粒子易于团聚，且化学稳定性不高易受氧化，表面羟基不足，导致其难以直接应用到生物领域。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种核酸提取磁珠的制备方法，其工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产；制得的核酸提取磁珠，其为核壳结构磁珠，具有良好的生物相容性，并能与核酸特异性结合；而且还提供上述核酸提取磁珠在核酸提取中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种核酸提取磁珠的制备方法，其包括以下步骤: SUFe3O4纳米颗粒的制备分别配制浓度为0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5~2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10-?/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60~70°C，再向混合液中滴加质量浓度为25%氨水至体系PH值为10~11，在温度为70~80°C条件下反应3~6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为I %氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10~-20°C冷冻干燥24~48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒； 其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理Ih后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100~300nm，饱和磁化强度较高为57.4~79.4 emu/g ； S2、纳米硅基磁珠的制备将步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2~500g分散到0.1~3L无水乙醇中超声波处理30?60min后，加入20?IOOOml浓度为10?50g/L的分散剂,搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25%氨水至体系PH值为10，再滴加0.25?500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1?0.5ml/min，体系温度为30?50°C，滴加完毕后反应3?5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6?7，超声分散15?30min，分散在万分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。进一步地，上述步骤S2中采用的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种混合。上述方法制得的硅基磁珠，其为核壳结构，包括Fe3O4纳米颗粒内核，SiO2外壳层，SiO2外壳层包覆在多个Fe3O4纳米颗粒外表面；硅基磁珠经超声分散处理Ih后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为400nm μ m，饱和磁化强度为43.0?74.5emu/g。上述方法制得的核酸提取磁珠，无外加磁场时，呈黑色悬浮液状态，放置有永磁铁时，核酸提取磁珠能够与水快速分离。上述方法制得的核酸提取磁珠，其应用于新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、种子、全血、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。上述方法制得的核酸提取磁珠，其应用于生物检材中核酸提取，包括以下步骤: (1)、裂解 取适量生物检材样本于EP管中，加入样本体积f 3倍的细胞裂解液、5?20 μ I蛋白酶K，混合均匀，再把EP管置于恒温水箱中65?80°C温育10?30min ； (2)、结合 将EP管从温浴设备中取出，加入振荡混匀的样本体积1/15?1/10的核酸提取磁珠、样本体积2倍的异丙醇，上下颠倒混匀，结合5?10 min，将EP管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液； (3 )、洗漆 a、加入样本体积3飞倍的洗涤液I，点振5?10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液； b、加入样本体积2?3倍的洗涤液II，点振5?10次，然后磁分离，吸净管盖及管底的残液； C、重复上述步骤b，室温下开盖干燥5min ； (4)、洗脱 加入50?300 μ I的洗脱液，缓慢抽吸混匀，65°C温浴lOmin，每隔2?3min轻摇EP管混匀，然后磁分离，小心吸取上清液至新的EP管中，进行下游实验； (5)、电泳检测 制备浓度1%琼脂糖凝胶，取上述提取的全血基因组进行电泳，25min后在凝胶成像系统上观察电泳结果。进一步地，上述的步骤(I)裂解中，对于动植物组织之类的固体样本，先研磨，离心取上清。由于采用如上所述的技术方案，本专利技术具有如下优越性: 本专利技术核酸提取磁珠的制备方法，其采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，利用超声辅助溶胶-凝胶法制备核酸提取磁珠，工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产；制得的核酸提取磁珠，饱和磁化强度较高为43.0?74.5emu/g，剩磁和矫顽力接近于零，能够在较小的磁场作用下达到快速彻底的固液分离效果，当撤去外加磁场后又能很快到分散到溶液中；制得的核酸提取磁珠，通过在Fe3O4纳米颗粒外表面包覆SiO2壳层，能很大程度地降低粒子的零电点和屏蔽磁偶极子的互相作用，使粒子具有良好的水溶性、化学稳定性及生物相容性，且SiO2表面存在丰富的羟基，可使复合粒子容易进一步生物功能化，能够有效吸附核酸，可用于提取含有常规量核酸(动植物、血液、细菌、质粒等)的生物检材，同时也能对含有痕量核酸(血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌、病毒等)的样本进行提取与纯化。【附图说明】图1是本专利技术实施例1中制备的纳米Fe3O4粒子的磁滞回线； 图2是本专利技术实施例1中制备的硅基磁珠在无磁场时在水中的悬浮状态图； 图3是本专利技术实施例1中制备的硅基磁珠在外加磁场中放置后的分离效果图； 图4是本专利技术实施例1中制备的硅基磁珠的磁滞回线； 图5是本专利技术实施例1中制备的娃基磁珠的放大200倍光学显微镜照片； 图6是本专利技术实施例1中制备的硅基磁珠的TEM照片； 图7是本专利技术实施例4中硅基磁珠应用于全血中核酸提取后基因组的琼脂糖凝胶电泳图像； 图8是本专利技术实施例5中硅基磁珠应用于三叶草叶片中核酸提取后基因组的琼脂糖凝胶电泳图像； 图9是本专利技术实施例6中硅基磁珠应用于人血清游离DNA提取后荧光定量PCR扩增曲线图。【具体实施方式】参照以下实施例可以对本专利技术作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本专利技术并不局限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸提取磁珠的制备方法，其特征是：其包括以下步骤：S1、Fe3O4纳米颗粒的制备分别配制浓度为0.1～1mol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5～2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇‑8000水溶液，聚乙二醇‑8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10~1/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60～70℃，再向混合液中滴加质量浓度为25％氨水至体系PH值为10～11，在温度为70～80℃条件下反应3～6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1％氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，‑10～‑20℃冷冻干燥24～48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理1h后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100～300nm，饱和磁化强度较高为57.4～79.4 emu/g；S2、纳米硅基磁珠的制备将步骤S1中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2～500g分散到0.1～3L无水乙醇中超声波处理30～60min后，加入20～1000ml浓度为10～50g/L的分散剂，搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25％氨水至体系PH值为10，再滴加0.25～500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1～0.5ml/min，体系温度为30～50℃，滴加完毕后反应3～5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6～7，超声分散15～30min，分散在万分之二NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。...

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取磁珠的制备方法，其特征是:其包括以下步骤: SUFe3O4纳米颗粒的制备 分别配制浓度为0.1~lmol/L的Fe3+和Fe2+盐溶液，按Fe3+与Fe2+物质的量的比为1.5~2.0混合；上述混合液搅拌均匀后，加入0.15mol/L的聚乙二醇-8000水溶液，聚乙二醇-8000体积为Fe盐溶液总体积的1/10-?/5，通入氩气除氧30 min，调整反应体系温度60~70°C，再向混合液中滴加质量浓度为25%氨水至体系PH值为10~11，在温度为70~80°C条件下反应3~6h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，依次用质量浓度为1%氨水、5%NaCl及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，-10~-20°C冷冻干燥24~48h，得到超顺磁性Fe3O4纳米颗粒； 其中磁性纳米Fe3O4粒子颗粒分散到超纯水中经超声分散处理Ih后，用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为100~300nm，饱和磁化强度较高为57.4~79.4 emu/g ； S2、纳米硅基磁珠的制备 将步骤SI中所得的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒称取2~500g分散到0.1~3L无水乙醇中超声波处理30~60min后，加入20~1000ml浓度为10~50g/L的分散剂,搅拌均匀后，向混合液中加入质量浓度为25%氨水至体系PH值为10，再滴加0.25~500ml体积比为1:1的正硅酸四乙酯与乙醇混合溶液，控制滴加速度为0.1~0.5ml/min，体系温度为30~50°C，滴加完毕后反应3~5h，磁分离出表面硅基修饰的Fe3O4纳米颗粒，用去离子水反复洗涤数次至洗涤液PH值为6~7，超声分散15~30min，分散在万分之二 NaN3水中，即得到硅基包被磁珠。2.根据权利要求1所述的核酸提取磁珠的制备方法，其特征是:步骤S2中采用的分散剂为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种组入口 ο3.—种权利要求1所述的制备方法制得的核酸提取磁珠，其特征是:其为核壳结...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜德光，冯凌云，齐存森，艾振江，肖理慧，冯爱青，
申请(专利权)人：洛阳惠尔纳米科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41