从生物样品中分离微泡和提取核酸的方法技术

本发明专利技术提供用于从生物样品中分离核酸、包括游离DNA和/或游离DNA和包括至少来自微泡的RNA的核酸以及用于从所述微泡和/或从所述生物样品中提取核酸的新型方法和试剂盒。

Method for separating microbubbles and extracting nucleic acids from biological samples

The present invention provides for the separation of nucleic acids, including free DNA and free DNA and / or including at least from RNA and nucleic acid microbubble used from the microbubbles and / or extraction of nucleic acids from the biological samples in the new method and kit from biological samples.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从生物样品中分离微泡和提取核酸的方法相关申请本申请要求2014年7月9日提交的美国临时申请号62/022,538、2014年11月14日提交的美国临时申请号62/079,763和2015年5月27日提交的美国临时申请号62/166,890的优先权和权益，上述美国临时申请中每一者的内容以全文通过引用并入本文。专利
本专利技术提供用于从生物样品中分离核酸、包括游离(cell-free)DNA和/或游离DNA和包括至少来自微泡的RNA的核酸以及用于从微泡和/或从生物样品中提取核酸的新型方法和试剂盒。背景细胞脱落的膜囊泡统称为微泡。来自各种细胞来源的微泡已关于蛋白质和脂质含量被广泛研究。最近，已发现微泡还含有DNA和RNA两者，包括基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、微RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)。由于细胞所脱落微泡中含有的遗传和蛋白质组信息，当前研究指向利用微泡来获得对这些细胞的状况的进一步洞悉，例如疾病状态或疾病素因。另外，当前研究还指向利用游离DNA来获得对细胞状况的进一步洞悉。因此，需要分离游离DNA和从生物样品中分离微泡的方法以及提取高质量核酸的方法，以用于医疗状况和疾病的准确诊断。
技术实现思路
本专利技术提供用于从样品中分离游离DNA(“cfDNA”，还称作循环DNA)和/或组合分离cfDNA和包括至少来自微泡的RNA的核酸的方法，所述方法通过将DNA、DNA和RNA和/或微泡捕获至表面，随后裂解微泡以释放其中含有的核酸、特别是RNA，并且从捕获表面洗脱DNA和/或DNA和包括至少RNA的核酸。本领域普通技术人员将理解微泡部分(microvesiclefraction)还包括DNA。因此，微泡部分的裂解释放RNA和DNA两者。此外，分离的DNA可来自各种来源中的任何一种，包括但不限于核小体和其他游离DNA来源。用于从样品中分离和提取核酸、例如cfDNA和/或DNA和包括至少来自样品的微泡部分的RNA的核酸的以前的程序依赖于使用超速离心，例如以多于10,000×g旋转1-3hr，接着移除上清液，洗涤小丸，裂解小丸和在柱上纯化核酸例如DNA和/或DNA和RNA。这些以前德方法展现出若干缺点，诸如缓慢、乏味，经受批间可变性，和不适合于可扩展性。本文提供的用于分离和提取的方法和试剂盒克服了这些缺点，并且提供基于旋转的柱以用于快速、稳健和可容易扩展至大体积的分离和提取。所述方法和试剂盒使用在本文中称为“EXO52”的以下通用程序来从样品中分离和提取核酸、例如DNA和/或DNA和包括至少RNA的核酸。首先，使样品中的核酸例如DNA和/或DNA和微泡部分结合至诸如膜过滤器的捕获表面，并且洗涤捕获表面。然后，使用试剂来执行核酸例如DNA和/或DNA和RNA的膜上裂解和释放。然后，使用PLG管执行氯仿提取，接着是乙醇调节。然后，使核酸例如DNA和/或DNA和RNA结合至硅胶柱，洗涤和洗脱。EXO52方法和试剂盒中使用的膜具有大孔并带正电。在一些实施方案中，在EXO52方法和试剂盒中使用多于一个膜，例如，使用两个或更多个膜。在一些实施方案中，使用三个膜。在EXO52方法和试剂盒中使用的膜数与可一次分析的样品总体积相关。在一些实施方案中，EXO52方法和试剂盒中使用的每层膜处理约1ml样品。在一些实施方案中，所述膜是带正电膜。在一些实施方案中，所述捕获表面是阴离子交换剂。在一些实施方案中，捕获表面是具有季胺的阴离子交换剂。在一些实施方案中，捕获表面是Q膜，其为带正电膜和具有季胺的阴离子交换剂。例如，Q膜用季铵官能化，R-CH2-N+(CH3)3。在一些实施方案中，膜具有至少3μm的孔径。包括微泡部分的样品的纯化使用离子交换技术来执行。在一些实施方案中，离子交换技术是选自本文提供的工作实例中所示那些的技术。在一些实施方案中，用于膜上裂解的试剂是苯酚基试剂。在一些实施方案中，裂解试剂是胍盐基试剂。在一些实施方案中，裂解试剂是高盐基缓冲液。在一些实施方案中，裂解试剂是QIAzol。在一些实施方案中，裂解试剂是苯酚基裂解试剂，例如QIAzol，并且它以约700ul的体积使用。在一个方面中，用于从生物样品中提取核酸的方法包括：(a)提供生物样品；(b)在足够使微泡部分保留于捕获表面上或中的条件下使生物样品与捕获表面接触；(c)在微泡处于捕获表面上或中的同时裂解微泡部分；以及(d)从微泡部分中提取核酸。或者，用于从生物样品中提取核酸的方法进一步包括在步骤(b)之后从捕获表面洗脱微泡部分，收集洗脱的微泡部分，并且从洗脱的微泡部分中提取核酸。任选地，洗脱的微泡部分可通过旋转浓缩器来浓缩以获得浓缩微泡部分，并且随后从浓缩微泡部分提取核酸。在另一个方面中，用于从生物样品中提取核酸的方法包括：(a)提供生物样品；(b)在足够使微泡部分保留于捕获表面上或中的条件下使生物样品与捕获表面接触；以及(c)在微泡处于捕获表面上或中的同时洗脱微泡部分。洗脱的微泡部分然后可经处理以用于进一步分析。任选地，洗脱的微泡部分可通过旋转浓缩器来浓缩以获得浓缩的微泡部分。在一些实施方案中，随后从浓缩微泡部分提取核酸。在一些实施方案中，捕获表面是膜。在一个方面中，膜包含再生纤维素。例如，膜具有至少1μm的孔径，诸如在2-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，膜具有在3-5μm之间范围内的孔径。在一些实施方案中，膜包含聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，膜带电。在一些实施方案中，膜带正电。在一些实施方案中，膜带负电。在一些方面中，膜被官能化。例如，膜用季铵官能化R-CH2-N+(CH3)3。在一个实施方案中，捕获表面包含多于一个膜。在一些实施方案中，捕获表面包含至少两个膜，其中每个膜相邻地紧挨其他一个或更多个膜。在一些实施方案中，捕获表面包含至少三个膜，其中三个膜中每一个直接彼此相邻。在一些实施方案中，捕获表面包含至少四个膜，其中四个膜中每一个直接彼此相邻。在一些实施方案中，捕获表面是微珠。例如，微珠是磁性的。或者，微珠是非磁性的。在又一个实施方案中，微珠用亲和配体官能化。在一些实施方案中，捕获表面是一种或更多种聚合物的浆液。在一些实施方案中，一种或多种聚合物的浆液成形为微珠。在一些实施方案中，生物样品是血浆。在一些实施方案中，生物样品是血清。在一些实施方案中，生物样品是尿液。在一些实施方案中，生物样品是脑脊液。在一些实施方案中，生物样品是细胞培养上清液。在一些方面中，本文所述的方法进一步包括使生物样品与加样缓冲液接触。加样缓冲液的pH在4-8范围内。在一个方面中，加样缓冲液具有中性pH。本文所述的方法提供从微泡中提取核酸。优选地，提取的核酸是DNA和/或DNA和RNA。提取的RNA可包含信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、或小RNA诸如微RNA，或者它们的任何组合。使用各种核酸测序技术来检测和分析核酸，诸如从来自生物样品的微泡部分中提取的游离DNA和/或RNA。由于其中可容易收集微泡的非侵入性质，出于诊断目的对核酸诸如游离DNA和/或提取自微泡的核酸进行的分析具有广泛的含意。使用微泡分析取代侵入性组织活检将积极影响患者福利，改进进行纵向疾病监测的能力，和改进获得表达谱的能力，甚至当组织细胞并非容易可及时(例如，在卵巢癌或脑癌患者中)也是如此。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从生物样品中提取DNA和RNA的方法，所述方法包括：(a)提供生物样品；(b)在足够使来自所述生物样品的游离DNA和微泡保留于捕获表面上或中的条件下，使所述生物样品与所述捕获表面接触，其中所述捕获表面包含带正电的膜，为用季铵官能化的阴离子交换剂的膜R‑CH2‑N

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.09 US 62/022,538;2014.11.14 US 62/079,763;1.一种用于从生物样品中提取DNA和RNA的方法，所述方法包括：(a)提供生物样品；(b)在足够使来自所述生物样品的游离DNA和微泡保留于捕获表面上或中的条件下，使所述生物样品与所述捕获表面接触，其中所述捕获表面包含带正电的膜，为用季铵官能化的阴离子交换剂的膜R-CH2-N+(CH3)3、或带正电并用季铵官能化的膜R-CH2-N+(CH3)3；(c)在游离DNA和所述微泡处于所述捕获表面上或中的同时，使所述捕获表面与苯酚基裂解试剂接触，从而从所述样品中释放所述DNA和RNA并且产生匀浆；(d)向所述匀浆添加氯仿；以及(e)从所述匀浆中提取所述DNA、所述RNA、或所述DNA和RNA两者。2.如权利要求1所述的方法，其中所述膜膜带正电。3.如权利要求1所述的方法，其中所述膜为用季铵官能化的阴离子交换剂R-CH2-N+(CH3)3。4.如权利要求1所述的方法，其中所述膜带正电并且为用季铵官能化的阴离子交换剂R-CH2-N+(CH3)3。5.如权利要求1所述的方法，其中所述膜具有至少3μm的孔径。6.如权利要求1所述的方法，其中所述捕获表面包含三个膜，其中所述三个膜直接彼此相邻。7.如权利要求6所述的方法，其中所述三个膜彼此相同。8.如权利要求7所述的方法，其中每个膜带正电。9.如权利要求7所述的方法，其中每个膜为用季铵官能化的阴离子交换剂R-CH2-N+(CH3)3。10.如权利要求7所述的方法，其中每个膜带正电并且为用季铵官能化的阴离子交换剂R-CH2-N+(CH3)3。11.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是血浆或血清。12.如权利要求11所述的方法，其中所述生物样品在0.2mL至4mL之间。13.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是尿液、脑脊液或细胞培养上清液。14.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)进一步包括通过过滤所述生物样品来处理所述生物样品。15.如权利要求14所述的方法，其中所述过滤使用0.8μm过滤器来执行。16.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)进一步包括在使所述生物样品与所述捕获表面接触之后的离心步骤。17.如权利要求1或权利要求16所述的方法，其中步骤(b)进一步包括在使所述生物样品与所述捕获表面接触之后洗涤所述捕获表面。18.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)进一步包括在使所述捕获表面与所述苯酚基裂解试剂接触之后的离心步骤。19.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：JKO斯科格，D恩德尔，A拉马钱兰，H颜，E伯格霍夫，TF魏，M内尔霍姆，
申请(专利权)人：外来体诊断公司，
类型：发明
国别省市：美国,US