用于分离微囊泡的方法技术

本发明专利技术提供了用于从生物样品中分离微囊泡且用于从微囊泡中提取核酸的新型方法。

A Method for Separating Microvesicles

【技术实现步骤摘要】
用于分离微囊泡的方法本申请是申请日为2014年1月3日，申请号为201480002901.2，专利技术名称为“用于分离微囊泡的方法”的专利技术专利申请的分案申请。本申请要求于2013年1月3日提交的美国临时申请号61/748,575的优先权和利益，所述美国临时申请的内容在此整体引入作为参考。
本专利技术提供了用于从生物样品中分离微囊泡且用于从微囊泡中提取核酸的新型方法和试剂盒。
技术介绍
由细胞脱落且直径<0.8µm的膜囊泡统称为微囊泡。来自多种细胞来源的微囊泡已关于蛋白质和脂质含量进行广泛研究。近来，已发现微囊泡还含有DNA和RNA，包括基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、微小RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA）。由于由细胞脱落的微囊泡中含有的遗传和蛋白质组学信息，目前研究旨在利用微囊泡以获得这些细胞状态的进一步了解，例如疾病状态或疾病倾向。相应地，存在从生物样品中分离微囊泡的方法，和提取高质量核酸用于医学状况和疾病的精确诊断的方法的需要。
技术实现思路
本专利技术提供了通过将微囊泡捕获至表面且随后裂解微囊泡以释放其中含有的核酸，用于分离微囊泡的方法和试剂盒。在一些实施方案中，该方法和试剂盒从微囊泡级分中分离且提取RNA。这些方法和试剂盒在本文中被称为基于EXO50或EXO50的方法和/或试剂盒。在一些实施方案中，该方法和试剂盒从微囊泡级分中分离且提取DNA。RNA随后可以加工用于进一步分析。这些方法和试剂盒在本文中被称为基于EXO52或EXO52的方法和/或试剂盒，并且可以包括EXO52方法和/或试剂盒的衍生物，在本文中被称为EXO52.2。DNA随后可以加工用于进一步分析。本专利技术还提供了通过将微囊泡捕获至表面且随后从捕获表面洗脱微囊泡，用于分离微囊泡的方法和试剂盒。这些方法和试剂盒在本文中被称为EXO51。微囊泡随后可以加工用于进一步分析。用于从生物样品中分离微囊泡级分且从微囊泡级分中提取核酸的先前操作依赖使用超速离心，例如以小于10,000xg旋转1-3小时，随后去除上清液，洗涤团块，裂解团块且在柱上纯化核酸例如RNA。这些先前方法证实几个缺点例如缓慢、繁琐、遭受分批之间的变异性，并且不适合于可扩展性。用于分离和提取的方法和试剂盒克服这些缺点，并且提供了用于分离和提取的基于旋转的柱，其是快速、稳健的且易于扩展至大体积。该方法和试剂盒使用下述一般操作从生物样品中分离且提取RNA，其在本文中被称为“EXO50”。首先，微囊泡级分与膜滤器结合，并且洗涤滤器。随后，使用试剂执行膜上裂解和RNA释放。氯仿提取随后使用PLG管执行，随后为乙醇条件化。RNA随后与二氧化硅柱结合，洗涤且随后洗脱。RNA随后加工用于进一步分析。在EXO50方法和试剂盒中使用的膜具有大孔，并且总体是带正电的。在一些实施方案中，超过一个膜用于EXO50方法和试剂盒中，例如使用两个或更多个膜。在一些实施方案中，使用三个膜。在一些实施方案中，使用超过三个膜。在一些实施方案中，每层膜是不同类型的膜。在一些实施方案中，每层膜是相同类型的膜。在一些实施方案中，膜层是至少两种不同类型的膜的组合。在一些实施方案中，每层膜由不同材料组成。在一些实施方案中，每层膜由相同材料组成。在一些实施方案中，每层膜是带电的。在一些实施方案中，至少一层是不带电的。在一些实施方案中，每层膜具有相同电荷。在一些实施方案中，每层膜具有相同电荷。在一些实施方案中，每层膜具有不同电荷。在一些实施方案中，膜或至少一层膜是带正电的膜。在一些实施方案中，捕获表面或至少一层是再生纤维素、强碱性阴离子交换剂（“RC/SBAE”）膜，其是带正电的膜并且是具有季胺的阴离子交换剂。例如，RC/SBAE膜由季铵，R-CH2-N+（CH3）3官能化。在一些实施方案中，膜具有至少3um的孔径。在EXO50方法和试剂盒中使用的膜数目与一次可以分析的总样品体积关联。在方法和试剂盒中使用的层数和每层的容量例如结合容量、流通率或其他量度影响可以使用的样品大小的总体积。当一层或每层具有更高的结合容量时，更多层可以用于方法和/或试剂盒中，并且当一层或每层具有更低的结合容量时，更少层可以用于方法和/或试剂盒中。此外，样品的粘度和组成也影响可以使用的样品大小的总体积。例如，在其中样品是血浆的一些实施方案中，约1ml样品加工用于EXO50方法和试剂盒中使用的每层膜。在一些实施方案中，用于膜上裂解的试剂是QIAzol。在一些实施方案中，QIAzol以约700ul的体积使用。该方法和试剂盒使用下述一般操作从生物样品中分离且提取DNA，其在本文中被称为“EXO52”。首先，微囊泡级分与膜滤器结合，并且洗涤滤器。随后，使用试剂执行膜上裂解和核酸例如RNA释放。随后执行乙醇沉淀，随后为裂解和蛋白酶降解。DNA随后与二氧化硅柱结合，洗涤且随后洗脱。DNA随后加工用于进一步分析。在EXO52方法和试剂盒中使用的膜具有大孔，并且总体是带正电的。在一些实施方案中，超过一个膜用于EXO52方法和试剂盒中，例如使用两个或更多个膜。在一些实施方案中，使用三个膜。在一些实施方案中，使用超过三个膜。在一些实施方案中，每层膜是不同类型的膜。在一些实施方案中，每层膜是相同类型的膜。在一些实施方案中，膜层是至少两种不同类型的膜的组合。在一些实施方案中，每层膜由不同材料组成。在一些实施方案中，每层膜由相同材料组成。在一些实施方案中，每层膜是带电的。在一些实施方案中，至少一层是不带电的。在一些实施方案中，每层膜具有相同电荷。在一些实施方案中，每层膜具有相同电荷。在一些实施方案中，每层膜具有不同电荷。在一些实施方案中，膜或至少一层膜是带正电的膜。在一些实施方案中，捕获表面或至少一层是再生纤维素、强碱性阴离子交换剂（“RC/SBAE”）膜，其是带正电的膜并且是具有季胺的阴离子交换剂。例如，RC/SBAE膜由季铵，R-CH2-N+（CH3）3官能化。在一些实施方案中，膜具有至少3um的孔径。在EXO52方法和试剂盒中使用的膜数目与一次可以分析的总样品体积关联。在方法和试剂盒中使用的层数和每层的容量例如结合容量、流通率或其他量度影响可以使用的样品大小的总体积。当一层或每层具有更高的结合容量时，更多层可以用于方法和/或试剂盒中，并且当一层或每层具有更低的结合容量时，更少层可以用于方法和/或试剂盒中。此外，样品的粘度和组成也影响可以使用的样品大小的总体积。例如，在其中样品是血浆的一些实施方案中，约1ml样品加工用于EXO52方法和试剂盒中使用的每层膜。在一些实施方案中，用于膜上裂解的试剂是QIAzol。在一些实施方案中，QIAzol以约700ul的体积使用。在EXO51方法和试剂盒中使用的膜具有大孔，并且总体是带正电的。在一些实施方案中，超过一个膜用于EXO51方法和试剂盒中，例如使用两个或更多个膜。在一些实施方案中，使用三个膜。在一些实施方案中，使用超过三个膜。在一些实施方案中，每层膜是不同类型的膜。在一些实施方案中，每层膜是相同类型的膜。在一些实施方案中，膜层是至少两种不同类型的膜的组合。在一些实施方案中，每层膜由不同材料组成。在一些实施方案中，每层膜由相同材料组成。在一些实施方案中，每层膜是带电的。在一些实施方案中，至少一层是不带电的。在一些实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从生物样品中提取核酸的方法，其包括：（a）提供生物样品；（b）在足以使微囊泡级分保留在捕获表面之上或其中的条件下，使所述生物样品与捕获表面接触；（c）在所述微囊泡处于所述捕获表面之上或其中时，裂解所述微囊泡级分；和（d）从所述微囊泡级分中提取核酸。

【技术特征摘要】
2013.01.03 US 61/7485751.一种用于从生物样品中提取核酸的方法，其包括：（a）提供生物样品；（b）在足以使微囊泡级分保留在捕获表面之上或其中的条件下，使所述生物样品与捕获表面接触；（c）在所述微囊泡处于所述捕获表面之上或其中时，裂解所述微囊泡级分；和（d）从所述微囊泡级分中提取核酸。2.权利要求1的方法，其中所述捕获表面是带正电的。3.权利要求1的方法，其中所述捕获表面是膜。4.权利要求3的方法，其中所述膜包含再生纤维素。5.权利要求3的方法，其中所述膜具有至少3um的孔径。6.权利要求3的方法，其中所述膜由季铵R-CH2-N+（CH3）3官能化。7.权利要求1的方法，其中所述捕获表面包含超过一个膜。8.权利要求7的方法，其中至少一个膜是荷电的。9.权利要求7的方法，其中所述捕获表面包含至少两个膜，其中每个膜具有不同电荷。10.权利要求7的方法，其中所述捕获表面包含三个膜，其中所述三个膜彼此直接邻近。11.权利要求10的方法，其中所述三个膜彼此相同。12.权利要求1的方法，其中所述生物样品是血浆、血清、尿、脑脊髓液或细胞培养物上清液。13.权利要求1的方法，其中所述步骤（a）进一步包括使所述生物样品与装载缓冲液接触。14.权利要求13的方法，其中所述装载缓冲液具有中性pH。15.权利要求1的方法，其中所述核酸包含RNA。16.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：D恩德尔，A拉马钱德兰，H颜，E伯格霍夫，TF魏，M内尔霍尔姆，JKO斯科格，
申请(专利权)人：外来体诊断公司，
类型：发明
国别省市：美国,US