从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA的自动和手动方法技术

本发明专利技术提供用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)的全自动高通量方法的新方法和试剂盒；用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)的新方法和试剂盒，其不需要使用苯酚或氯仿；以及用于从细胞外囊泡和/或生物样品中提取核酸的新方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA的自动和手动方法相关申请本申请要求2016年5月13日提交的美国临时申请号62/336,203的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
本专利技术提供用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA）的全自动高通量方法的新方法和试剂盒；用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA）的新方法和试剂盒，其无需使用苯酚或氯仿；和用于从细胞外囊泡和/或生物样品中提取核酸的新方法和试剂盒。背景在分子生物学领域，来自混合有机材料诸如植物、微生物培养物、动物组织和血液的纯净的分离的分子的制备物是至关重要的。分析所述分离的材料是很多下游过程的先决条件。存在样品分离技术的各种方法，并非所有方法同等良好地适用于每种应用。尤其是当样品材料中的分子有限且下游测定技术旨在高度灵敏时，提取技术尤为重要。对于液体活检就是这种情况，其中考虑诊断目的而分析人类生物液体。因此，样品分离的技术进展可对当前的护理标准产生广泛而深远的影响。人类生物液体包含细胞以及无细胞来源的分子。无细胞来源包括细胞外囊泡及其内携带的分子（如RNA、DNA、脂质、小的代谢产物和蛋白质）以及可能源自凋亡和坏死的组织的无细胞DNA。由于每个来源的分子的绝对量很低(例如Bettegowdaetal.2014SciTranslMed)，从临床样品体积中共分离所有可用的分子和能够使用大量的起始材料是理想的。此外，为低成本/高通量提取，在液体处理装置上使提取方法自动化是理想的。因此，对于从同一生物液体体积中共提取细胞外囊泡和无细胞DNA的基于珠的方法，和为精确诊断医学状况及疾病而提取高质量核酸的方法，存在需要。专利技术概述本专利技术提供用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)的改进方法的新方法和试剂盒。一方面，这些新方法和试剂盒可供从生物液体中自动分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)。另一方面，这些新的方法和试剂盒可供从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)，其无需使用苯酚或氯仿。本专利技术提供如下从生物样品中提取DNA和RNA的方法：(a)提供生物样品；(b)在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；和(c)当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆。本专利技术也提供如下从生物样品中提取DNA和RNA的方法：(a)提供生物样品；(b)在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；和(c)当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆；和(d)从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者。在某些实施方案中，固体捕获表面是珠子。在某些实施方案中，固体捕获表面是膜。在某些实施方案中，固体捕获表面是磁性的。在某些实施方案中，珠子是离子交换（IEX）珠。在某些实施方案中，珠子是带正电荷的。在某些实施方案中，珠子是带负电荷的。在某些实施方案中，珠子被季胺官能化。在某些实施方案中，珠子被硫酸盐、磺酸盐、叔胺、任何其它IEX基团和其任何组合官能化。在某些实施方案中，IEX珠是磁性高容量IEX珠。在某些实施方案中，IEX珠是强铁磁性的高容量珠。在某些实施方案中，IEX珠是强铁磁性的高容量的含氧化铁的磁性聚合物。在某些实施方案中，IEX珠没有表面暴露于易氧化的液体。在某些实施方案中，IEX珠具有高的珠电荷:暴露表面比。在某些实施方案中，生物样品是血浆、血清或尿液。在某些实施方案中，生物样品的体积是0.2至20mL。在某些实施方案中，生物样品是尿液，其中所述尿液样品使用初次捕集尿液收集装置收集。在某些实施方案中，初次捕集尿液收集装置是EZPZ、Colli-Pee或其它市售可得的初次捕集收集装置。在某些实施方案中，基于GTC的洗脱缓冲液包括变性剂、洗涤剂、缓冲物质及其组合。在某些实施方案中，基于GTC的洗脱缓冲液包括变性剂和还原剂。在某些实施方案中，还原剂是β巯基乙醇（BME）。在某些实施方案中，还原剂是三（2-羧乙基）膦（TCEP）。在某些实施方案中，还原剂是DTT。在某些实施方案中，步骤（d）还包括从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者之前，向匀浆中添加蛋白沉淀缓冲液。在某些实施方案中，步骤（d）还包括酶消化。在某些实施方案中，步骤（d）包括蛋白酶消化。在某些实施方案中，此步骤在提前将材料从固体表面洗脱或不洗脱的情况下进行。在某些实施方案中，此步骤用最佳温度、GTC浓度、洗涤剂含量、酶浓度和时间进行。在某些实施方案中，步骤（d）包括使用蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及其组合进行消化。在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液包括过渡金属离子、缓冲剂或过渡金属离子和缓冲剂二者。在某些实施方案中，过渡金属离子是锌。在某些实施方案中，一种或多种后续缓冲液包含至少一种物质，以抵消下游分析中过渡离子的潜在携带。在某些实施方案中，抵消物质是螯合剂。在某些实施方案中，抵消物质是EDTA。在某些实施方案中，使用至少一种另外的二价阳离子螯合剂。在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液的规定pH范围是3.1至4.1。在某些实施方案中，缓冲剂是乙酸钠（NaAc）。在某些实施方案中，步骤（a）还包括通过过滤生物样品来处理生物样品。在某些实施方案中，过滤使用0.8µm的滤器进行。在某些实施方案中，步骤（b）还包括在生物样品与捕获表面接触后的离心步骤。在某些实施方案中，步骤（b）还包括在生物样品接触捕获表面之后清洗捕获表面。在某些实施方案中，步骤（c）还包括在捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触之后的离心步骤。在某些实施方案中，步骤（d）还包括在匀浆中加入核酸控制标记。在某些实施方案中，此方法还包括步骤（f）结合蛋白沉淀洗脱液至硅胶柱；和步骤（h）从硅胶柱上洗脱提取物。在某些实施方案中，步骤（c）包括从表面将完整的囊泡洗脱。在某些实施方案中，此方法使用pH的变化。在某些实施方案中，此方法使用离子强度的变化。在本文提供的任意实施方案中，本方法可以适用于分离细胞外囊泡和/或无细胞DNA的任何高通量方法。在某些实施方案中，所有的步骤使用磁珠作为固体捕获表面。在某些实施方案中，此方法在自动液体处理平台上实施。在某些实施方案中，此方法在微流现场装置上实施。在某些实施方案中，使用轨道振动器或其它混合装置将分离物与表面有效结合。在某些实施方案中，步骤（d）包括使用基于二氧化硅的固体表面。在某些实施方案中，固体表面是旋转柱膜。在某些实施方案中，固体表面是珠子。在某些实施方案中，步骤（b）包括使用化学拥挤剂以增强EV和cfDNA与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括：(a)提供生物样品；(b)在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；(c)当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆；以及(d)从匀浆中提取DNA、RNA，或DNA和RNA二者。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.13 US 62/3362031.从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括：(a)提供生物样品；(b)在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；(c)当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆；以及(d)从匀浆中提取DNA、RNA，或DNA和RNA二者。2.权利要求1的方法，其中固体捕获表面是珠子。3.权利要求1的方法，其中固体捕获表面是柱膜。4.权利要求1的方法，其中固体捕获表面是磁性的。5.权利要求2或4的方法，其中珠子是离子交换（IEX）珠。6.权利要求2的方法，其中珠子是带正电荷的。7.权利要求2的方法，其中珠子是带负电荷的。8.权利要求2的方法，其中珠子是用季胺官能化的。9.权利要求2的方法，其中珠子是用硫酸盐、磺酸盐、叔胺、任何其它IEX基团和其任何组合官能化的。10.权利要求5的方法，其中IEX珠是磁性高容量的IEX珠。11.权利要求5的方法，其中IEX珠是强铁磁性的高容量珠。12.权利要求5的方法，其中IEX珠是强铁磁性、高容量、含氧化铁的磁性聚合物。13.权利要求5的方法，其中IEX珠没有表面暴露于易氧化的液体。14.权利要求5的方法，其中IEX珠具有高的珠电荷:暴露表面比。15.权利要求1的方法，其中生物样品是血浆、血清或尿液。16.权利要求1或15的方法，其中生物样品在0.2至20mL之间。17.权利要求1或15的方法，其中生物样品是尿液，且其中尿液样品使用初次捕集尿液收集装置收集。18.权利要求1的方法，其中基于GTC的洗脱缓冲液包含变性剂、洗涤剂、缓冲物质和其组合。19.权利要求18的方法，其中基于GTC的洗脱缓冲液包含变性剂和还原剂。20.权利要求19的方法，其中还原剂是β巯基乙醇（BME）。21.权利要求19的方法，其中还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP）。22.权利要求19的方法，其中还原剂是二硫苏糖醇（DTT）。23.权利要求1的方法，其中步骤（d）进一步包括从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者之前向匀浆添加蛋白沉淀缓冲液。24.权利要求1的方法，其中步骤（d）还包括酶消化。25.权利要求24的方法，其中步骤（d）包括蛋白酶消化。26.权利要求24或25的方法，其中步骤（d）在提前将材料从固体表面洗脱或不洗脱的情况下进行。27.权利要求24或25的方法，其中步骤（d）用最佳温度、GTC浓度、洗涤剂含量、酶浓度、时间和温度进行。28.权利要求24的方法，其中步骤（d）包括使用蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及其组合进行消化。29.权利要求23的方法，其中蛋白沉淀缓冲液包括过渡金属离子、缓冲剂，或过渡金属离子和缓冲剂二者。30.权利要求29的方法，其中过渡金属离子是锌。31.权利要求21的方法，其中一种或多种后续缓冲液包含至少一种物质，以抵消下游分析中过渡离子的潜在携带。32.权利要求31的方法，其中抵消物质是一种螯合剂。33.权利要求31的方法，其中抵消物质是EDTA。34.权利要求30至33中任一项的方法，其中所述方法还包括添加至少一种另外的二价阳离子螯合剂。35.权利要求29的方法，其中蛋白沉淀缓冲液的规定pH范围是3.1至6.1。36.权利要求35的方法，其中缓冲剂是乙酸钠（NaAc）。37.权利要求1的方法，其中步骤（a）还包括通过过滤生物样品来处理生物样品。38.权利要求37的方法，其中过滤使用0.8µm的滤器进行。39.权利要求1的方法，其中步骤（b）还包括将生物样品与捕获表面接触后的离心步骤。40.权利要求1或39的方法，其中步骤（b）还包括将生物样品与捕获表面接触后，清洗捕获表面。41.权利要求1的方法，其中步骤（c）还包括将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触后的离心步骤。42.权利要求1的方法，其中步骤（d）还包括向匀浆加入核酸控制标记。43.权利要求1的方法，其中所述方法还包括步骤（f）结合蛋白沉淀洗脱液至硅胶柱；和步骤（h）将提取物从硅胶柱上洗脱。44.权利要求1的方法，其中步骤（c）包括从表面将完整的囊泡洗脱。45.权利要求44的方法，其中所述方法使用pH的变化。46.权利要求44的方法，其中所述方法使用粒子强度的变化。47.权利要求1的方法，其中所述方法用于生物样品中核酸的高通量分离。48.权利要求47的方法，其中全部步骤采用磁性珠作为固体捕获表面。49.权利要求47的方法，其中所述方法在自动液体处理平台上实施。50.权利要求47的方法，其中所述方法在微流现场装置上实施。51.权利要求47的方法，其中使用轨道振动器或其它混合装置将分离物与表面有效结合。52.权利要求1的方法，其中步骤（d）包括使用基于二氧化硅...

【专利技术属性】
技术研发人员：G斯托尔，D恩德尔，M内尔霍姆，JKO斯科格，
申请(专利权)人：外来体诊断公司，
类型：发明
国别省市：美国,US