被称作胞外体的细胞囊泡,其制备方法及在免疫刺激中的用途技术

本发明专利技术的目的是提供一种使抗原呈递细细胞敏感化的新方法，实施该方法的新颖方式以及具有免疫原特性的新颖膜囊泡。本发明专利技术具体涉及肿瘤细胞胞外体（ｔｅｘｏｓｏｍｅｓ，衍生自肿瘤细胞的囊泡）及树状细胞胞外体（ｄｅｘｏｓｏｍｅｓ，衍生自带有或未带有抗原的树状细胞的囊泡）及其在活体外或活体中引导及呈递抗原的用途，以及用于治疗癌症及感染性、寄生性或自体免疫性疾病的方法或组合物。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,其制备方法及在免疫刺激中的用途的制作方法
本专利技术的目的为提供一种使抗原呈递细胞敏感化的新颖方法，实施该方法的新颖方式以及具有免疫原特性的新颖膜囊泡。自从证明对在第I类分子环境内的肿瘤抗原具有特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞确实存在(Rosenberg等人，1996；Boon，1992)后，数个实验室已能证明抗肿瘤免疫治疗在动物模型中为有效的治疗策略(Pardoll，1995)。免疫治疗的原理是诱导出对抗特异性肿瘤抗原的有效免疫反应。至目前为止，其可以数种不同方式进行。首先，表达重组共刺激分子和/或免疫调节细胞因子的肿瘤细胞在活体内能刺激抗肿瘤反应而根除实体肿瘤(Zitvogel等人，1996{a})。同样地，以各种化学形式(包括使用脂质体或病毒如腺病毒或痘病毒做为载体)被注射的肿瘤抗原(或在肿瘤细胞中表达的外源抗原)的肽衍生物能使肿瘤缓解。最后，专业的抗原呈递细胞诸如用衍生自肿瘤抗原的肽敏感化的树状细胞，当被再注射入活体时，在小鼠体内会诱生强烈的抗肿瘤反应以及使小鼠已生成的实体肿瘤缓解(Mayordomo等人，1995)。使用树状细胞的免疫疗法在以小鼠进行的研究中显示具有效力。结果，该治疗最近已被转用于临床。在美国，正在进行多个试验以证明带有肿瘤肽的树状细胞能明显增加特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的比率。该途径的第一个限制在于用衍生自肿瘤抗原的肽使树状细胞敏感化。事实上，大多数肿瘤特异性抗原尚未被鉴定出。对肿瘤具特异性的抗原只在由病毒诱生的肿瘤(子宫颈瘤)、黑色素瘤(自体抗原、突变抗原、分化抗原)或一小部分的乳房肿瘤(致癌基因或已发生突变的肿瘤抑制基因的产物)中为已知。不过，这些肽或肿瘤抗原在人体中与清除肿瘤的关系尚待证明。因此，抗原呈递细胞诸如树状细胞的新颖敏感化方法显然是必需的。这些方法的目的是诱生在MHC的第I类及第II类分子的环境中的特异性抗肿瘤反应。目前树状细胞敏感化的大多数方法使用对应于表位的肽，该表位与第I类分子一起被呈递且通过对肿瘤具特异性的CTL克隆而在肿瘤细胞中被鉴定出。不过，这些方法可能并非最佳，因为其未将在第II类分子的环境中鉴别到的表位考虑在内，而第II类分子对于获得最佳细胞毒性反应所需的辅助性T淋巴细胞的增殖相当重要。再者，肿瘤细胞所呈递的表位与抗原呈递细胞(例如树状细胞)所呈递的那些可能不同。最后，通过CTL鉴别到的肿瘤肽只有在一小部分的具有适当第I类单倍体型的分子的患者中可以得到。理想的敏感化方法，亦即一种可应用于任何肿瘤且其免疫选择性极小的方法，必须不局限于少数已被鉴定的肿瘤抗原。同样地，该方法应利用完整的蛋白质抗原而非肽，以使树状细胞能制备它们并将肽与第I类及第II类分子的适当组合呈现出来，以及该方法对任何个体皆是可行的。最近，Gilboa及其同僚(Boczkowsky等人；1996)已证明从带有树状细胞的肿瘤活体解剖制备的信使RNAs在活体中可能具有抗肿瘤作用。不过，RNAs非常不稳定以及有潜力的RNA的量与全部RNA相较可能极低。Zitvogel等人(Zitvogel等人，1996{b})已证明从酸性肿瘤洗脱物(酸性肽洗脱物APE)制得的肿瘤肽可被载入树状细胞中。如此负载的细胞一旦被注射，具有使肿瘤缓解的能力，不过，在不表达第I类分子的肿瘤(代表大部分的转移性人类肿瘤)的场合，或在肿瘤在细胞悬浮液中不会分解的场合，使用酸性洗脱物的途径极为无效且不具再现性。以使用树状细胞为基础的免疫疗法的第二个限制是在将这些细胞维持在培养基中或接受不同处理时，可能发生表型改变。此可能导致细胞群体极不均匀以及无足以供治疗使用的特定特征。所以需要一种使抗原呈递细胞敏感化的改良方法，以增加这些途径的效率及扩大其的应用范围，同时开发出承载抗原及其他分子的新颖方式。本专利技术提供这些问题的解决方法。本专利技术的目的事实上为提供一种将抗原呈递细胞(尤其是树状细胞)敏感化的新颖方法，以及具显著免疫原性质的新颖膜囊泡的鉴定、分离及鉴定特征的方法。更具体而言，本专利技术的特征之一是提供一种通过肿瘤抗原使抗原呈递细胞敏感化的新颖、可再现的方法。本专利技术的再一特征是提供一种通过肿瘤抗原使抗原呈递细胞敏感化的新颖、可再现的方法，其中肿瘤抗原无需为已知的。本专利技术的另一特征是提供一种可以建立肿瘤抗原库的方式。本专利技术的又一特征在于由肿瘤细胞或树状细胞产生的具有免疫原性质的脂质膜囊泡，以及其在抗原库的制造、抗原呈递细胞的敏感化或抗原的承载上，尤其是在免疫治疗途径方面的用途。关于此，本专利技术的第一目的涉及衍生自肿瘤细胞的囊泡，其具有下列特征—其自天然环境游离出，—其包含环绕胞质部分的脂质双层(被称为“表面”)，以及可选择地具有下列特征—其在表面上显示主要组织相容性复合物(MHC)的第I类分子和/或主要组织相容性复合物(MHC)的第II类分子，以及可选择性地带有抗原肽和/或粘附分子和/或淋巴共同刺激分子，和/或—其在胞质部分含有肿瘤抗原分子和/或免疫调节剂和/或化学-吸引剂和/或激素和/或核酸。囊泡被细胞分泌是现有技术所描述的一种现象(网状细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞)。这些囊泡通常被通称为“胞外体”，此术语反映其通过内部囊泡的胞外分泌而制造的机制。不过，这些囊泡的生理角色未曾被真正确立。再者，这些囊泡的结构特征、性质及功能视其自何种细胞类型衍生而有何不同。出乎意料之外地，本专利技术者现已证明肿瘤细胞能分泌显示特别令人感到兴趣的免疫性质的囊泡。这些囊泡通常对应于肿瘤细胞的胞内体中所含的内部囊泡，以及在该胞内体的外膜与上述肿瘤细胞的细胞膜融合后被该肿瘤细胞分泌。基于该形成机制、其细胞来源及原始功能性质，这些囊泡被称为“肿瘤细胞胞外体”(texosome)。术语“自其天然环境游离出”意指囊泡与衍生其的细胞发生物理性分离，甚至其被部分分离或纯化。囊泡通常通过胞外分泌被细胞制造，然后被部分分离或纯化以制造富化组合物。该术语表示囊泡不仅在多囊泡胞内体与浆膜融合时被细胞分泌，而且还指它不再被胞内体腔内的可溶性成分环绕或者其缺乏完整的细胞。术语“衍生自肿瘤细胞”表示囊泡具有肿瘤细胞的结构成分。该囊泡通常“衍生”自肿瘤细胞的意思为在其发育的特定阶段，其至少部分地被肿瘤细胞制造继而释出。按照本专利技术的一有利实施方案，本专利技术的肿瘤细胞胞外体展示带有抗原肽的MHC分子和/或表达黏附分子和/或表达淋巴共同刺激分子，但在其胞质部分缺乏肿瘤抗原分子、免疫调节剂及核酸。按照本专利技术的另一有利实施方案，本专利技术的肿瘤细胞胞外体为其中的MHC分子“空着”(即未带有抗原性肽)的，以及该肿瘤细胞胞外体在其胞质部分包含肿瘤抗原分子、免疫调节剂及核酸。其MHC分子为空着的肿瘤细胞胞外体一则可自(例如)缺乏肽转运蛋白(TAP)的肿瘤细胞得到，一则可通过冲洗肿瘤细胞胞外体或肿瘤细胞以将与MHC分子缔合的肽解离而得到。按照本专利技术的一有利实施方案，本专利技术的肿瘤细胞胞外体为其MHC分子带有抗原肽和/或表达粘附分子和/或淋巴共同刺激分子，以及该肿瘤细胞胞外体在其胞质部分含有肿瘤抗原分子、免疫调节剂及核酸。术语“肿瘤细胞”在其广义上包含任何衍生自肿瘤，例如实体或液体肿瘤的任何细胞，以及在体外被转化或无限增殖化的细胞。其优选指实体、腹水性或造血性肿瘤。可被提及的例子为恶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种衍生自肿瘤细胞的囊泡，其特征为：－其自天然环境中游离出来，以及－其由环绕胞质部分的脂质双层构成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦斯齐沃格尔，格拉萨拉波索，阿梅利勒尼奥，塞巴斯蒂昂阿米戈雷纳，
申请(专利权)人：法国国家卫生及研究医学协会，法国古士塔柏罗斯学院，法国国家科学研究中心，法国居里学院，
类型：发明
国别省市：FR[法国]