包括视网膜下递送治疗有效量的重组AAV9衍生载体的在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法技术

眼内注射腺相关病毒(AAV)载体已经是将基因药物递送到视网膜中的明确途径。目前，需要将所述载体注射到视网膜下空间中以向视锥细胞提供基因递送。在这种方法中，基因递送限于与注入流体局部“小泡”接触的细胞。此外，视网膜下注射期间发生的视网膜脱离在具有视网膜变性的眼睛中是一种隐患。在此，本发明专利技术人建立了几种新的载体‑启动子组合以克服与中央凹中AAV介导的视锥细胞转导有关的局限性，并在小鼠模型、人类诱导多能干细胞衍生的类器官、人类死后视网膜外植体和活猕猴中进行了支持性研究。他们表明，AAV9变体当被注入距中央凹几毫米远的视网膜下空间中时，提供了有效的中央凹视锥细胞转导，且不会使这个脆弱的区域脱离。这种递送方式依赖于视锥细胞特异性启动子，并导致与光遗传学视力恢复相容的高水平转基因表达。因此，本发明专利技术涉及在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法，所述方法包括视网膜下递送治疗有效量的重组AAV9衍生载体，所述载体包含如SEQ ID NO:11所示的VP1衣壳蛋白以及在如SEQ ID NO:12所示的pR1.7启动子控制下的目的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包括视网膜下递送治疗有效量的重组AAV9衍生载体的在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法
本专利技术涉及一种重组AAV9衍生载体(AAV9-derivedvector)，并涉及其应用，特别是在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法，所述方法包括视网膜下递送治疗有效量的重组AAV9衍生载体。
技术介绍
位于黄斑中心的中央凹是视网膜的一个专门区域，其通过提供高度敏锐的色觉来主导灵长类动物的视觉感知(1)。发现在中央凹的中心(距中央凹中心<0.3mm)处视锥细胞密度最高，但缺乏视杆细胞光感受器(2)。视锥细胞密度随着距中央凹的距离降低多达100倍(3)。中央凹中的视锥细胞是旨在治疗遗传性视网膜疾病如中期色素性视网膜炎(4，5)和全色盲(6)的基因疗法的主要靶标。目前，为了向视锥细胞提供基因递送，需要将编码治疗蛋白的病毒载体注射到光感受器和视网膜色素上皮(RPE)细胞之间的视网膜下空间中。在这种方法中，用常规AAV(即AAV2)进行基因传递限于与注入流体局部“小泡(bleb)”接触的细胞。此外，视网膜下注射期间发生的视网膜脱离在具有视网膜变性的眼睛中是一种隐患。最早的临床试验是在Leber先天性黑蒙症患者(7–9)中利用视网膜下递送腺相关病毒(AAV)来递送健康的RPE65基因，该试验尽管为了递送病毒载体而使黄斑脱离，但带来一定的视力改善(10，11)。然而，该治疗在某些情况下并发黄斑裂孔并在中央凹下注射的情况下增加了黄斑变薄(11)。此外，与周边区域相反，在中央凹中没有治疗益处(12)。还研究了对无脉络膜症患者使用AAV的基因疗法，其中黄斑是基因递送的靶标(13)。迄今为止，来自这后一项研究的6个月随访结果提示，中央凹下视网膜脱离并不会导致该区域中视力下降，但是，该试验中一名患者的经治疗的眼睛与他的未经治疗的眼睛相比较，有视觉敏锐度损失(13)。随着更多的基因疗法到达临床应用阶段，越来越需要找到将基因疗法递送到中央凹而不使该脆弱的区域脱离的新方法(14)。这可以通过使用横向扩散以到达中央凹区域的载体在周边进行视网膜下注射来实现。
技术实现思路
本专利技术涉及一种重组AAV9衍生的载体，并涉及其应用，包括在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法，所述方法包括视网膜下递送治疗有效量的重组AAV9衍生载体。特别地，本专利技术由权利要求书限定。在第一方面，本专利技术涉及一种用于治疗影响视锥细胞光感受器的视网膜疾病的重组AAV9衍生载体，所述载体包含：-VP1衣壳蛋白，其中相对于相应的野生型AAV9衣壳蛋白，在所述衣壳蛋白的GH环中插入了7至11个氨基酸长度的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:8中的任一个；和-在如SEQIDNO:12所示的pR1.7启动子或所述启动子的功能变体控制下的目的多核苷酸。优选地，相对于如SEQIDNO:10所示的野生型AAV9衣壳蛋白，所述肽被插入GH环中氨基酸588和589之间。优选地，所述肽包含SEQIDNO:9或由SEQIDNO:9组成。优选地，所述重组AAV9衍生载体包含如SEQIDNO:11所示的VP1衣壳蛋白和在如SEQIDNO:12所示的pR1.7启动子控制下的目的多核苷酸。优选地，由重组AAV9衍生载体治疗的对象患有选自下列的视网膜疾病：年龄相关性黄斑变性，Bassen-kornzweig综合征，无脉络膜症，回旋状萎缩，Refsum综合征，Usher综合征，色盲，蓝色视锥细胞单色视(blueconemonochromacy)，全色盲，不完全性全色盲，寡视锥细胞三色视觉(oligoconetrichromacy)，色素性视网膜炎(RP)，黄斑变性，Stargardt病，Bardet-Biedl综合征，Bornholm眼病，Best病，和Leber先天性黑蒙症。优选地，所述目的多核苷酸是可用于基因替代疗法的基因，优选选自编码色素性视网膜炎GTP酶调节因子(RPGRORF15)、CNGB3(视锥细胞环核苷酸门控阳离子通道的β亚基)、CNGA3(视锥细胞环核苷酸门控阳离子通道的α亚基)或GNAT2的基因。优选地，所述目的多核苷酸编码神经营养因子。更优选地，所述目的多核苷酸编码RdCVF、RdCVF2、RdCVFL或RdCVFL2。优选地，所述目的多核苷酸编码视蛋白，例如视紫红质、光视蛋白、L/M波长(红/绿)视锥细胞视蛋白、或短波长(S)视锥细胞视蛋白(蓝)。更优选地，所述目的多核苷酸编码由如SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15所示的氨基酸序列组成的视蛋白。优选地，所述目的多核苷酸编码提供基因功能的位点特异性敲除的位点特异性核酸内切酶，所述核酸内切酶选自锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸内切酶。更优选地，所述目的多核苷酸编码Cas9核酸酶。优选地，所述目的多核苷酸编码干扰RNA(RNAi)，特别是siRNA或shRNA。优选地，所述目的多核苷酸编码反义寡核苷酸。优选地，所述治疗包括视网膜下递送治疗有效量的重组AAV9衍生载体。优选地，所述视网膜下递送在中央凹的一定距离处进行，不会使所述区域脱离。在另一方面，本专利技术涉及一种重组AAV9衍生载体，所述载体包含：-VP1衣壳蛋白，其中相对于相应的野生型AAV9衣壳蛋白，在所述衣壳蛋白的GH环中插入了7至11个氨基酸长度的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:8中的任一个；和-在如SEQIDNO:12所示的pR1.7启动子或所述启动子的功能变体控制下的目的多核苷酸。优选地，所述肽如上所述。优选地，所述重组AAV9衍生载体包含如SEQIDNO:11所示的VP1衣壳蛋白和在如SEQIDNO:12所示的pR1.7启动子控制下的目的多核苷酸。优选地，所述目的多核苷酸如上所述。在另一方面，本专利技术涉及一种在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法，所述方法包括视网膜下递送治疗有效量的所述重组AAV9衍生载体。具体实施方式我们对于在灵长类动物眼睛的视网膜下空间的解剖学独特环境内AAV转导模式的了解上的缺口阻碍了在临床中建立向中央凹视锥细胞的无创而有效的基因递送。在此，本专利技术人建立了几种新的载体-启动子组合以克服与中央凹中AAV介导的视锥细胞转导相关的局限性，并在小鼠模型、人类诱导多能干细胞衍生的类器官、人类死后视网膜外植体和活猕猴中进行了支持性研究。他们表明，AAV9变体当被注入距中央凹几毫米远的视网膜下空间中时，提供了有效的中央凹视锥细胞转导，且不会使这个脆弱的区域脱离。这种递送方式依赖于视锥细胞特异性启动子，并导致与光遗传学视力恢复相容的高水平转基因表达。因此，本专利技术的第一个目的涉及一种重组AAV9衍生载体，所述载体包含：-VP1衣壳蛋白，其中相对于相应的野生型AAV9衣壳蛋白，在所述衣壳蛋白的GH环中插入了7至11个氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗影响视锥细胞光感受器的视网膜疾病的重组AAV9衍生载体，所述载体包含：/n-VP1衣壳蛋白，其中相对于相应的野生型AAV9衣壳蛋白，在所述衣壳蛋白的GH环中插入了7至11个氨基酸长度的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8中的任一个；和/n-在如SEQ ID NO:12所示的pR1.7启动子或所述启动子的功能变体控制下的目的多核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171020 EP 17306430.41.一种用于治疗影响视锥细胞光感受器的视网膜疾病的重组AAV9衍生载体，所述载体包含：
-VP1衣壳蛋白，其中相对于相应的野生型AAV9衣壳蛋白，在所述衣壳蛋白的GH环中插入了7至11个氨基酸长度的肽，其中所述肽包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:8中的任一个；和
-在如SEQIDNO:12所示的pR1.7启动子或所述启动子的功能变体控制下的目的多核苷酸。


2.根据权利要求1所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中相对于如SEQIDNO:10所示的野生型AAV9衣壳蛋白，所述肽被插入GH环中氨基酸588和589之间。


3.根据权利要求1或2所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中所述肽包含SEQIDNO:9或由SEQIDNO:9组成。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的供使用的重组AAV9衍生载体，所述重组AAV9衍生载体包含如SEQIDNO:11所示的VP1衣壳蛋白和在如SEQIDNO:12所示的pR1.7启动子控制下的目的多核苷酸。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中所述对象患有选自下列的视网膜疾病：年龄相关性黄斑变性，Bassen-kornzweig综合征，无脉络膜症，回旋状萎缩，Refsum综合征，Usher综合征，色盲，蓝色视锥细胞单色视，全色盲，不完全性全色盲，寡视锥细胞三色视觉，色素性视网膜炎(RP)，黄斑变性，Stargardt病，Bardet-Biedl综合征，Bornholm眼病，Best病，和Leber先天性黑蒙症。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中所述目的多核苷酸是能用于基因替代疗法的基因，优选选自编码色素性视网膜炎GTP酶调节因子(RPGRORF15)、CNGB3(视锥细胞环核苷酸门控阳离子通道的β亚基)、CNGA3(视锥细胞环核苷酸门控阳离子通道的α亚基)或GNAT2的基因。


7.根据权利要求1至5中任一项所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中所述目的多核苷酸编码神经营养因子。


8.根据权利要求7所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中所述目的多核苷酸编码RdCVF、RdCVF2、RdCVFL或RdCVFL2。


9.根据权利要求1至5中任一项所述的供使用的重组AAV9衍生载体，其中所述目的多核苷酸编码视蛋白，例如视紫红质、光视蛋白、L/M波长(红/绿...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹妮兹·达尔卡拉，哈南·卡布，若泽阿兰·萨赫勒，蒂埃里·莱维拉德，延斯·迪贝尔，
申请(专利权)人：法国国家卫生及研究医学协会，索邦大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR