TIPE-2和NRDP1重组复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种TIPE‑2和NRDP1重组复合物及其制备方法和应用，该重组复合物由多肽复合物和双基因表达盒构成。多肽复合物包含穿膜肽Transportan9(TP9)LKALLGKIN和正电荷多肽KKKKKKKKK构成。双基因表达盒包含一个TIPE‑2 RNAi和NRDP1双基因表达盒，该表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、TIPE‑2基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、NRDP1基因和终止子；该重组复合物的制备方法简单；将其体内回输脑出血的血肿周围组织，能够抑制巨噬细胞活化，有效抑制脑出血的炎症反应和脑水肿，并抑制神经供能损伤，为脑出血的治理提供理想的策略。

【技术实现步骤摘要】
TIPE-2和NRDP1重组复合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种重组复合物，特别涉及一种TIPE-2和NRDP1重组复合物，还涉及该重组复合物的制备方法和应用。
技术介绍
脑出血(intracerebralhemorrhage，ICH)是临床上常见的脑血管病,缺乏有效的治疗方法，病死率和致残率较高。脑出血几天后的继发性神经损伤是病情加重的关键时期。继发性神经损伤的机制复杂，可能涉及血肿周围脑水肿形成、血肿周围代谢异常、血肿周围局部脑血流量(rCBF)的变化等。相关研究表明，巨噬细胞介导的炎症反应在脑出血继发性神经损伤中具有重要重要。巨噬细胞具有高度异质性，局部微环境的改变会导致巨噬细胞表现出不同的功能表型。巨噬细胞被分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可以分泌诱导Th1细胞免疫反应的效应分子，促进炎症反应。M2型巨噬细胞诱导Th2型免疫应答，产生抗炎性细胞因子，具有促进组织修复和重建的能力。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(tumornecrosisfator-α-inducedprotein8-like2，TIPE-2)最早在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中发现，主要表达于胸腺、淋巴结等组织及巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞，在免疫反应中发挥重要的负向调节作用。研究发现TIPE-2在系统性红斑狼疮、慢性乙肝病毒感染及哮喘中表达均有改变，并通过诱导巨噬细胞极化减轻炎症反应。我们实验表明，脑出血后周围血肿组织有大量的M1型巨噬细胞活化，分泌IL-6、TNF-α等炎症介质，加重了神经功能损伤；脑出血后的代谢产物可以增加巨噬细胞的TIPE-2表达，促进巨噬细胞M1极化。泛素(ubiquitin)系统是细胞中蛋白质的重要降解机制，而且通过调控底物蛋白的活性，参细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等生命过程。泛素化是天然免疫以及获得性免疫过程中重要的蛋白修饰手段。新近研究表明，泛素化修饰参与了巨噬细胞Ml/M2的极化过程。NRDP1(neuregulinreceptordegradationprotein1)是一种最新发现的泛素E3连接酶。深入研究发现NRDP1对Toll样受体诱导的巨噬细胞活化具有双向调控作用：一方面诱导MyD88的泛素化降解，抑制炎性细胞因子和趋化因子的产生；另一方面，NRDP1还可以促进TBK1及下游IRF3分子的活化，增加IFN-β的分泌。我们实验表明，脑出血后的代谢产物可以降低巨噬细胞的NRDP1表达上调，促进巨噬细胞M1极化。基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。巨噬细胞是体内的免疫调节细胞，可以在体内微环境的作用下，分化为促进或抑制免疫应答反应的免疫细胞。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染巨噬细胞，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种TIPE-2和NRDP1双基因共表达重组复合物，能够诱导抑制性巨噬细胞，有效抑制脑出血后的免疫活化，并提高神经功能；目的之二在于提供所述TIPE-2和NRDP1重组复合物的制备方法；目的之三在于提供所述TIPE-2和NRDP1重组复合物的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1、TIPE-2和NRDP1重组复合物及其制备方法和应用，该重组复合物由多肽复合物和双基因表达盒构成。2.多肽复合物包含穿膜肽Transportan9(TP9)LKALLGKIN和正电荷多肽KKKKKKKKK构成。3.双基因表达盒包含一个TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒，4.TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒，其特征在于：所述重组复合物基因组中包含一个TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒，所述TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、TIPE-2RNAi基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、NRDP1基因和终止子。5、所述TIPE-2RNAi和NRDP1双基因共表达重组复合物的制备方法，包括以下步骤：a、RT-PCR扩增TIPE-2RNAi全长；b、RT-PCR扩增NRDP1cDNA全长；c、将步骤a所得TIPE-2RNAi全长插入pCDNA3.1载体的IRES上游，步骤b所得NRDP1cDNA全长插入pCDNA3.1载体的IRES下游，得重组载体pCDNA3.1-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1；d、以步骤c所得重组载体pCDNA3.1-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1为模板，PCR扩增TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1片段并更换该片段两端的酶切位点；e、将步骤d所得TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1片段插入复合物穿梭载体pShuttle-CMV的CMV启动子下游，得重组复合物穿梭载体pShuttle-CMV-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1；f、将步骤e所得重组复合物穿梭载体pShuttle-CMV-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1与复合物骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌o157中进行胞内同源重组，得重组复合物载体pAd-TIPE-2RNAi/NRDP1；g、将重组复合物载体pAd-TIPE-2RNAi/NRDP1在293细胞中包装成重组复合物Ad-TIPE-2RNAi/NRDP1。h.在搅拌条件下，向溶解有Ad-TIPE-2RNAi/NRDP1的0.9％的PBST溶液中滴加溶解有多肽复合物的水溶液，滴加完毕后继续搅拌10分钟，再静置10分钟，即得。进一步，步骤a的具体方法为：提取人肝组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH1和Bst1酶切位点的TIPE-2RNAi全长，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-TIPE-2；进一步，步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamHⅠ和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TIPE-2和NRDP1重组复合物及其制备方法和应用，该重组复合物由多肽复合物和双基因表达盒构成。多肽复合物包含穿膜肽Transportan 9(TP9)LKALLGKIN和正电荷多肽KKKKKKKKK构成。双基因表达盒包含一个TIPE-2 RNAi和NRDP1双基因表达盒。/n

【技术特征摘要】
1.TIPE-2和NRDP1重组复合物及其制备方法和应用，该重组复合物由多肽复合物和双基因表达盒构成。多肽复合物包含穿膜肽Transportan9(TP9)LKALLGKIN和正电荷多肽KKKKKKKKK构成。双基因表达盒包含一个TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒。


2.TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒，其特征在于：所述重组复合物基因组中包含一个TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒，所述TIPE-2RNAi和NRDP1双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、TIPE-2RNAi基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、NRDP1基因和终止子。


3.权利要求1所述TIPE-2RNAi和NRDP1双基因共表达重组复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、RT-PCR扩增TIPE-2RNAicDNA全长；
b、RT-PCR扩增NRDP1cDNA全长；
c、将步骤a所得TIPE-2RNAicDNA全长插入pCDNA3.1载体的IRES上游，步骤b所得NRDP1cDNA全长插入pCDNA3.1载体的IRES下游，得重组载体pCDNA3.1-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1；
d、以步骤c所得重组载体pCDNA3.1-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1为模板，PCR扩增TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1片段并更换该片段两端的酶切位点；
e、将步骤d所得TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1片段插入复合物穿梭载体pShuttle-CMV的CMV启动子下游，得重组复合物穿梭载体pShuttle-CMV-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1；
f、将步骤e所得重组复合物穿梭载体pShuttle-CMV-TIPE-2RNAi-IRES-NRDP1与复合物骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌O157中进行胞内同源重组，得重组复合物载体pAd-TIPE-2RNAi/NRDP1；
g、将重组复合物载体pAd-TIPE-2RNAi/NRDP1在293细胞中包装成重组复合物Ad-TIPE-2RNAi/NRDP1。


4.根据权利要求2所述TIPE-2RNAi和NRDP1重组复合物的制备方法，其特征在于：步骤a的具体方法为：提取人肝组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH1和Bst1酶切位点的TIPE-2RNAi全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-TIPE-2RNAi。


5.根据权利要求3所述TIPE-2RNAi和NRDP1重组复合物的制备方法，其特征在于：步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨曌，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属永川医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50