一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其包括根据靶序列设计PLMMamp引物，其中所述PLMMamp引物包括模板杂交区核苷酸序列、靶区域延伸区核苷酸序列以及连接所述模板杂交区核苷酸序列和靶区延伸区核苷酸序列的中间链接区核苷酸序列，所述模板杂交区核苷酸序列位于扩增子核苷酸序列内，所述靶区域延伸区核苷酸序列位于扩增子核苷酸序列边界，且所述模板杂交区核苷酸序列与所述靶区域延伸区核苷酸序列无重叠。本发明专利技术中，PLMMamp(Pad‑Lock Mediated Mutiplex Amplification)引物可以在单管内完成多重PCR捕获，极大的降低了劳动成本和耗用成本。另外一方面，本发明专利技术的PLMMamp引物由于具有杂交区和延伸区双区功能，因此，能够很好的避开重复区的非特异性扩增现象，降低非特异性扩增产物。

A Single Tube Continuous Region Nonspecific PCR Amplification Method

【技术实现步骤摘要】
一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法
本专利技术实施例涉及基因工程
，具体涉及一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法及单管实现多重PCR扩增方法。
技术介绍
随着技术的进步，高通量测序技术由LifeSciences公司开发出，2005年春发表人类历史上第一篇高通量测序文章(Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactors)，展示了广阔的应用前景。通过高通量测序可以得到SNP、CNV、InDel、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。很多物种基因组较大，比如人基因组，有30亿个碱基，而在很多研究中，并不需要对全基因组进行测序，因此需要特定多靶区域测序的方法。这其中主要以探针捕获和多重PCR两种方法为主，首先安捷伦2009年第一次推出探针靶向捕获的技术，并于2010年推出第一个人外显子区域捕获产品。多重PCR技术应用于高通量测序最早见于LifeTechnologies于2012年推出的Ampliseq技术，该技术的推出，使得小而精的靶向区域捕获迅速的进入科研和临床应用。另外，联川生物在2014年推出了基于特殊引物设计(OMEGA引物)的多重技术，将两轮PCR方式简化为一轮。PadlockPrimer最早由MNilsson等人于1994年提出，用于单点的SNP检测效果明显；再后来，哈佛大学的GeorgeM.Church等人第一次将PadLock结构的Probe用于靶区域测序。随着技术的发展和进步，2016年，美国专利描述了利用互补结构解决了两扩增子之间的重叠区扩增问题，实现单管PCR可以进行连续区域的捕获，解决了传统多重PCR捕获实现连续区域需要分多管PCR的局限。Ampliseq技术虽然最早提出了多重捕获的技术方法，但对连续区域并未能实现单管内捕获，且AmpliSeq技术并未体现降低基因组非特异性扩增的技术；OMEGA引物的多重技术也能实现多重PCR捕获效果，同时，其OMEGA结构的引物，可以降低非特异性基因组扩增，且能将实验在一轮PCR内完成，但对于连续区域的捕获，仍然需要分两管或者多管以上。PadlockPrimer各个文章仍然用的是单条Probe通过连接酶介导链接方法来实现单点以及小区域的靶向捕获，该方法需要的基因组投入量较大，且时间较长，一般需要2天左右时间。而在Ampliseq技术基础上做了较大改进，采用重叠区域相邻两扩增子的引物序列有互补成为茎环结构，可以实现连续区域的PCR靶向捕获，但该方法并没有解决对重复区附近或者相似序列的非特异性扩增的问题。综上所述，现有技术中，在基因测序的过程中，无法通过单管扩增实现对连续区域的基因捕获，并且具有明显降低特异性基因组扩增的效果。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，以解决现有技术中无法通过单管扩增实现对连续区域基因进行捕获的问题。为了实现上述目的，本专利技术的实施方式提供如下技术方案：一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其包括：根据扩增的靶序列设计PLMMamp引物，其中，所述PLMMamp引物包括模板杂交区核苷酸序列、靶区域延伸区核苷酸序列以及连接所述模板杂交区核苷酸序列和靶区延伸区核苷酸序列的中间链接区核苷酸序列，所述模板杂交区核苷酸序列为扩增子核苷酸序列一部分，所述靶区域延伸区核苷酸序列为扩增子核苷酸序列边界区的一部分，且所述模板杂交区核苷酸序列与所述靶区域延伸区核苷酸序列无重叠。优选的，还包括多重PCR扩增方法，根据多个把序列设计多对所述PLMMamp引物。优选的，所述多重PCR扩增中，相邻所述靶序列的重叠区内，所述PLMMamp引物的中间链接区的核苷酸序列相同。优选的，所述模板杂交区核苷酸序列与所述中间链接区核苷酸序列采用无法用于扩增的非碱基修饰，如C3、C6基因修饰。优选的，所述PLMMamp引物3’端为靶区域延伸区核苷酸序列，5’端为模板杂交区核苷酸序列，靶区域延伸区核苷酸序列TM值的范围在40-50度之间，所述模板杂交区核苷酸序列TM值范围在65-75度之间。优选的，所述中间链接区核苷酸序列的核苷酸碱基的数量至少为1个。优选的，所述靶序列为微生物核苷酸序列、人染色体核苷酸序列、动物染色体核苷酸序列或植物染色体核苷酸序列。优选的，所述模板杂交区核苷酸序列的碱基数量为12-25个；所述靶区域延伸区核苷酸序列的碱基数量为15-40个。优选的，所述PCR扩增采用具有双链5’-3’外切活性的DNA聚合酶。本专利技术还提供单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法获得的PCR产物在测序中的应用，其中，所述中间链接区核苷酸序列采用高通量测序平台通用序列。根据本专利技术的实施方式，本专利技术实施例的一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法具有如下优点：本专利技术中，PLMMamp(Pad-LockMediatedMutiplexAmplification)技术结合PadLockPrimer技术特点，利用PCR上下游引物均采用PadLock结构的引物，其中3’端作为靶区延伸区，TM(meltingtemperature)设置较低，5’端作为杂交区，TM值设置较高；对于有重叠区临近扩增子，设计时，5’端的模板杂交区在重叠区之外，这样重叠区的扩增就无法进行，原先连续区域多重捕获需要分多管的，可以在单管内完成多重PCR捕获，极大的降低了劳动成本和耗用成本。另外一方面，本专利技术的PLMMamp引物由于具有杂交区和延伸区双区功能，因此，能够很好的避开重复区的非特异性扩增现象，降低非特异性扩增产物。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。图1为本专利技术的实施例提供的利用本专利技术的PLMMamp引物PCR扩增测序的技术流程图；图2为本专利技术的实施例1的常规PCR引物和PLMMamp引物PCR扩增产物的电泳图，其中，Lane1：PLMMamp引物PCR产物电泳条带；Lane2：常规引物PCR产物电泳条带；LaneM：DNA标准marker。图3为本专利技术的实施例2常规PCR引物和PLMMamp引物PCR扩增产物的电泳图，Lane1：常规引物PCR产物电泳条带；Lane2：PLMMamp引物PCR产物电泳条带；LaneM：DNA标准marker。图4为本专利技术的实施例3常规PCR引物和PLMMamp引物PCR扩增产物的电泳图；Lane1-1，1-2，1-3：常规设计BRCA引物PCR产物电泳条带；Lane2-1,2-2,2-3:PLMMamp设计引物PCR产物电泳条带；LaneM：DNA标准marker。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其特征在于包括：根据扩增的靶序列设计PLMMamp引物，其中，所述PLMMamp引物包括模板杂交区核苷酸序列、靶区域延伸区核苷酸序列以及连接所述模板杂交区核苷酸序列和靶区延伸区核苷酸序列的中间链接区核苷酸序列，所述模板杂交区核苷酸序列为扩增子核苷酸序列一部分，所述靶区域延伸区核苷酸序列为扩增子核苷酸序列边界区的一部分，且所述模板杂交区核苷酸序列与所述靶区域延伸区核苷酸序列无重叠。

【技术特征摘要】
1.一种单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其特征在于包括：根据扩增的靶序列设计PLMMamp引物，其中，所述PLMMamp引物包括模板杂交区核苷酸序列、靶区域延伸区核苷酸序列以及连接所述模板杂交区核苷酸序列和靶区延伸区核苷酸序列的中间链接区核苷酸序列，所述模板杂交区核苷酸序列为扩增子核苷酸序列一部分，所述靶区域延伸区核苷酸序列为扩增子核苷酸序列边界区的一部分，且所述模板杂交区核苷酸序列与所述靶区域延伸区核苷酸序列无重叠。2.如权利要求1所述的单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其特征在于，还包括多重PCR扩增方法，根据多个把序列设计多对所述PLMMamp引物。3.如权利要求2所述的单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其特征在于，所述多重PCR扩增中，相邻所述靶序列的重叠区内，所述PLMMamp引物的中间链接区的核苷酸序列相同。4.如权利要求1所述的单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法，其特征在于，所述模板杂交区核苷酸序列与所述中间链接区核苷酸序列采用无法用于扩增的非碱基修饰，如C3、C6基因修饰。5.如权利要求1所述的单管实现连续区域的非特异性PCR扩增方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨吉元，刘建全，杨骁，张嘉楠，
申请(专利权)人：上海何因生物科技有限公司，上海优甲医疗科技有限公司，深圳人体密码基因科技有限公司，石家庄博瑞迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31