【技术实现步骤摘要】
一种用于构建细菌16SrDNA全长高通量测序文库的方法
本专利技术属于微生物基因高通量测序领域，具体涉及一种用于构建细菌16SrDNA全长高通量测序文库的方法。
技术介绍
16S核糖体核糖核酸(ribosomalRNA,rRNA)为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA是编码该亚基的基因，存在于所有细菌基因组中，长度约为1.5Kb，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16SrDNA包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16SrDNA常用于研究特定环境中的物种信息，包括物种差异、物种分类和物种丰度等，对复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。几十年来，16SrDNA已被广泛应用于分类学和系统发育关系的确定。16S扩增子测序即通过提取环境样品的基因组DNA，选择合适的通用引物扩增16SrDNA某一或某几个区，通过测序检测目的区域的序列变异和丰度，对环境样本的物种分类、丰度、种群结构、系统进化、群落比较等信息进行分析的研究方法。16SrDNA在细菌的基因组中存在多个拷贝，...
【技术保护点】
1.一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样本中的细菌基因组DNA：采集环境样本，提取样本中的细菌基因组DNA；2)在每个16S rDNA模板分子两端分别加上不同的UMI标记：首先经过两轮独立的退火、延伸步骤，将随机碱基组成的特异性标签序列(Unique Molecular Identifier,UMI)加在每个16S rDNA模板分子两端，然后经PCR扩增得到多个拷贝的两端含不同UMI标记的16S rDNA全长扩增子；3)构建16S rDNA全长文库：包括含单端UMI序列的文库和含双端UMI序列的文库的构建；3a)构建...
【技术特征摘要】
1.一种用于构建细菌16SrDNA全长高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样本中的细菌基因组DNA：采集环境样本，提取样本中的细菌基因组DNA；2)在每个16SrDNA模板分子两端分别加上不同的UMI标记：首先经过两轮独立的退火、延伸步骤，将随机碱基组成的特异性标签序列(UniqueMolecularIdentifier,UMI)加在每个16SrDNA模板分子两端，然后经PCR扩增得到多个拷贝的两端含不同UMI标记的16SrDNA全长扩增子；3)构建16SrDNA全长文库：包括含单端UMI序列的文库和含双端UMI序列的文库的构建；3a)构建含单端UMI序列的文库：将步骤2)得到的16SrDNA全长扩增子，使用含P7序列和生物素(Biotin)修饰的上下游引物进行PCR扩增，得到两端含P7序列且含Biotin修饰的产物，将产物进行随机片段化并切胶回收500～1000bp的DNA片段，特异性富集含Biotin标记的DNA片段，进行末端缺口补齐修复，并将修复的DNA片段的3’端加上脱氧腺苷酸A，并与3’端带有突出的脱氧胸苷酸T的P5接头连接，经PCR扩增后，纯化回收产物，即得到含单端UMI序列的文库，其结构特点是含左端UMI和16SrDNA中间序列的片段，或含右端UMI和16SrDNA中间序列的片段；3b)构建含双端UMI序列的文库：将步骤2)得到的16SrDNA全长扩增子，在3’端加上脱氧腺苷酸A，并与含biotin修饰且3’端带有突出“T”碱基的接头连接，经环化反应形成含biotin修饰的环状DNA分子；在DNA外切酶的作用下，去掉未环化的DNA分子；将环状DNA产物随机打断得到300-1000bp的DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈祖耕，毕书琳，王成，
申请(专利权)人：杭州进一生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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