尿液和其他样品中无细胞DNA的分析制造技术

可以通过分析无细胞DNA来检测特定器官的疾病(例如，癌症)。一些实施方案可以使用来自特定器官或通过特定器官的器官相关样品，例如可以在尿液、唾液、血液和粪便样品中进行。在一些实施方案中，可以测量样品中的无细胞DNA的甲基化水平。组织特异性甲基化模式可用于确定来自不同组织类型的分数贡献。在其他实施方案中，可以测量器官相关的无细胞DNA的大小。大小分布的统计测量表明，与非健康组织比较，无细胞DNA片段总体上比具有健康组织的受试者所预期的要长。在其它实施方案中，可以分析两个不同的样品以确定特定器官是否患有癌症。可以分析血液样品和器官相关样品中的无细胞DNA，以鉴定表现出拷贝数异常的染色体区域。

Analysis of acellular DNA in urine and other samples

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】尿液和其他样品中无细胞DNA的分析相关申请的交叉引用本申请要求2016年11月30日提交的标题为“尿液和其他样品中无细胞DNA的分析”的美国临时申请第62/427,999号的优先权，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文中。
技术介绍
在人体体液中发现的细胞外DNA的短片段在凋亡和坏死期间从濒死细胞释放(1)。来源于胎儿(2)、肿瘤细胞(3)和移植同种异体移植物(4)的循环血浆中的无细胞(cf)DNA的分析使得能够开发非侵入性产前检查(5)、‘液体活检’评估肿瘤(6,7)和监测移植器官的临床状态(8)。尿液分析是真正的非侵入性并且了解尿cfDNA的来源对于指导其临床用作“液体活检”的形式是有用的。从无细胞尿液上清液中分离的DNA可大致归类为来自肾前、肾脏或肾后系统。使用输血(9)、妊娠(9–11)、造血干细胞移植(12)、非泌尿恶性肿瘤(13,14)、肾移植(15)、和膀胱癌(16,17)作为模型系统，多个研究组已经证明，从全身循环、肾脏和肾后尿路上皮得出尿cfDNA的比例。以前的研究集中于在一个时间从所关注的单个源检测cfDNA，并且从特定源得出的尿cfDNA量有大的变化。每个组织来源对总尿cfDNA的比例贡献是未知的，并且在一些研究中，感兴趣来源的cfDNA的浓度极低，或者甚至检测不到(15,16,18)。因此，难以使用尿液(或除血液之外的非侵入性活组织检查，例如唾液或粪便样品)来检测癌症或其他疾病。其他技术分析点突变监测先前诊断有癌症患者。然而，这些技术不易于修改为无症状患者的广泛适用的筛查技术以诊断癌症。必须在检测到癌症之前鉴定特定的点突变。因此，可能仅筛选众所周知的点突变用于筛选，或者必须通过先前针对先前检测器肿瘤的侵入性活检来鉴定患者的特定点突变。
技术实现思路
实施方案可以分析用于特定器官的疾病检测(例如癌症)的无细胞DNA。一些实施方案可以使用来自特定器官或通过特定器官的器官相关样品，例如可以在尿液、唾液、血液和粪便样品中进行。可以以各种方式进行分析。在一些实施方案中，无细胞DNA的甲基化水平可以在样品中进行测定。组织特异性甲基化模式可用于确定来自不同组织类型的分数贡献。一种组织类型可以是特定器官的特定疾病的患病组织类型。患病组织类型的分数贡献可用于确定样品中特定疾病的水平(分类)。例如，可以使用甲基化模式确定癌性膀胱衬细胞的百分比，并且该百分比可以用于确定癌症水平。在其它实施方案中，器官相关的无细胞DNA的大小可以被测量。在使用从膀胱排泄的尿液样品的实例中，可以测量天然存在于尿液中的无细胞DNA片段的大小分布。大小分布的统计测量可以表明无细胞DNA片段总体上比具有健康膀胱组织的受试者预期的长。较长片段的指示可用于鉴定受试者中的膀胱癌。在使用尿液样品的另一个实例中，尿液样品可以从肾盂中取出。可以基于统计测量来确定肾脏是否发炎，该统计测量表明无细胞DNA片段总体上比具有未发炎的肾脏的受试者预期的长。在其它实施方案中，两个不同的样品可以被分析以确定特定器官是否患有癌症。可以分析血液样品和器官相关样品(例如，尿液、唾液或粪便样品)中的无细胞DNA，以鉴定表现出拷贝数异常的染色体区域。如果血液样品不指示癌症并且器官相关样品指示癌症，那么可以将受试者鉴定为在与样品相关的器官中患有癌症。例如，对于尿液样品，可以将受试者鉴定为患有膀胱癌。还可以检测其他癌症，例如泌尿道癌症、由尿路上皮引起的移行细胞癌和肾癌。其它实施例涉及与本文描述的方法相关联的系统和计算机可读介质。参考以下详细描述和附图，可以更好地理解本专利技术实施方案的性质和优点。附图说明图1显示了根据本专利技术实施方案从肾、尿路上皮、B细胞、T细胞和嗜中性粒细胞鉴定的19,418个差异甲基化区域中的甲基化密度。每条垂直线代表基于甲基化密度进行颜色编码的单个差异甲基化区域。具有高甲基化密度的差异甲基化区域(DMR)用红色表示，而具有低甲基化密度的基因座用黄色表示。图2是显示根据本专利技术实施方案的在膀胱肿瘤、B细胞、尿路上皮、肾、嗜中性粒细胞和T细胞中27,371个差异甲基化区域(DMR)的甲基化密度的热图。图3显示了根据本专利技术实施方案的来自造血干细胞移植(HSCT)(三角形)和肾移植(圆点)患者的31个尿样中来自血细胞和肾的cfDNA的比例贡献。图4A-4C显示了根据本专利技术的实施方案，使用不同组织特异性甲基化模式定义的分数的膀胱癌病例和无癌对照的甲基化反卷积图，包括正常尿路上皮细胞(图4A)、作为单一组织特异性甲基化模式的尿路上皮和膀胱癌细胞(图4B)和作为单独的组织特异性甲基化模式的尿路上皮和膀胱癌细胞(图4C)。图5是说明根据本专利技术的实施方案使用患病组织类型的组织特异性甲基化模式分析生物的生物样品的方法500的流程图。图6A显示了根据本专利技术实施方案的六种膀胱癌病例和六种对照的每毫升尿液的基因组当量(GE)的总cfDNA浓度。图6B显示了根据本专利技术实施方案的六种膀胱癌病例和六种对照的膀胱肿瘤GE指数值。图7A和7B显示了根据本专利技术实施方案的来自代表性HSCT患者(图7A)和肾移植患者(图7B)的受体和供体DNA的尿cfDNA大小分布。图8A和8B显示了根据本专利技术实施方案的来自右肾(其由于结石而被阻塞)的肾盂和来自左肾的排泄尿液的cfDNA的大小分布。图9A和9B是根据本专利技术的实施方案，在37℃体外孵育0、3和6小时时来自肾盂尿液的cfDNA的大小分布。图10A和10B显示了根据本专利技术的实施方案，与温育(a)3小时和(b)6小时的肾盂尿液相比，排泄尿液的大小分布。图11A和11B是显示根据本专利技术实施方案的31种HSCT与肾移植尿液样品的cfDNA片段大小参数之间的关系的图。图12A和12B显示了根据本专利技术实施方案的来自肾盂(图12A)和排泄尿(图12B)的尿液的37℃体外温育实验期间尿cfDNA的浓度。图13A-13D.根据本专利技术的实施方案，在37℃下从0至12小时体外孵育排泄尿液cfDNA的大小分布。图14是根据本专利技术的实施方案的分析来自生物体肾脏的肾盂的尿液样品以确定器官损伤程度(例如，炎症水平)的方法1400的流程图。图15A和15B显示了根据本专利技术实施方案的来自两例肌肉侵入性膀胱癌的手术前和手术后尿样的大小分布。图16A-16C显示了根据本专利技术实施方案的来自患有膀胱癌的患者的三个排泄尿样的大小分布。图17A-17C显示根据本专利技术的实施方案，来自三名接受TURBT的非肌肉侵入性膀胱癌患者的三个术前尿样的大小分布。图18显示了根据本专利技术的实施方案，使用尿液cfDNA的大小分析生物体的尿液样品以检测膀胱癌的方法1800的流程图。图19A和19B显示了根据本专利技术实施方案，在对照、具有Ta-T1疾病的膀胱癌患者和患有T2-T4疾病的膀胱癌患者中尿液cfDNA片段的比例长于70bp(P>70bp)的箱线图。图20显示了Circos图，其显示了根据本专利技术实施方案的尿cfDNA和膀胱癌组织之间的全局甲基化和拷贝数异常的一致性。图21A-21E显示了根据本专利技术实施方案的来自五个膀胱癌患者(A-E)的尿cfDNA的全局甲基化和拷贝数异常的Circos图。图22A和22B显示了根据本专利技术实施方案的T22的膀胱癌肿瘤(19A)和cf尿液(19B)的Circos图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析生物体的生物样品的方法，所述生物样品包括来自包括第一组织类型的多种组织类型的无细胞DNA分子的混合物，所述方法包括：鉴定N个基因组位点，N是大于或等于10的整数；对于M个组织类型的每一个：获得N个基因组位点处的N个组织特异性甲基化水平，N大于或等于M，其中所述组织特异性甲基化水平形成维度N×M的矩阵A，其中M个组织类型中的一个对应于第一患病组织类型，所述第一患病组织类型对应于第一器官的第一疾病；通过计算机系统分析来自所述生物样品的多个无细胞DNA分子，所述多个无细胞DNA分子是至少1,000个无细胞DNA分子，其中分析无细胞DNA分子包括：鉴定所述无细胞DNA分子在对应于所述生物体的参考基因组中的位置；鉴定所述多个无细胞DNA分子中的一组，其每个均位于所述N个基因组位点中的任何一个处，使用所述组的多个无细胞DNA分子测量所述N个基因组位点处的N个混合物的甲基化水平；通过计算机系统，使用所述N个混合物的甲基化水平和所述M个组织类型的每一个的所述N个组织特异性甲基化水平，确定所述混合物中第一患病组织类型的第一分数贡献；和使用第一患病组织类型的第一分数贡献确定所述生物体中第一器官的第一疾病的水平。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.30 US 62/427,9991.一种分析生物体的生物样品的方法，所述生物样品包括来自包括第一组织类型的多种组织类型的无细胞DNA分子的混合物，所述方法包括：鉴定N个基因组位点，N是大于或等于10的整数；对于M个组织类型的每一个：获得N个基因组位点处的N个组织特异性甲基化水平，N大于或等于M，其中所述组织特异性甲基化水平形成维度N×M的矩阵A，其中M个组织类型中的一个对应于第一患病组织类型，所述第一患病组织类型对应于第一器官的第一疾病；通过计算机系统分析来自所述生物样品的多个无细胞DNA分子，所述多个无细胞DNA分子是至少1,000个无细胞DNA分子，其中分析无细胞DNA分子包括：鉴定所述无细胞DNA分子在对应于所述生物体的参考基因组中的位置；鉴定所述多个无细胞DNA分子中的一组，其每个均位于所述N个基因组位点中的任何一个处，使用所述组的多个无细胞DNA分子测量所述N个基因组位点处的N个混合物的甲基化水平；通过计算机系统，使用所述N个混合物的甲基化水平和所述M个组织类型的每一个的所述N个组织特异性甲基化水平，确定所述混合物中第一患病组织类型的第一分数贡献；和使用第一患病组织类型的第一分数贡献确定所述生物体中第一器官的第一疾病的水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述M个组织类型中的第二个对应于第二患病组织类型，第二患病组织类型对应于第一器官的第二疾病，所述方法还包括：通过计算机系统，使用所述N个混合物的甲基化水平和所述M个组织类型的每一个的所述N个组织特异性甲基化水平，确定所述混合物中第二患病组织类型的第二分数贡献；和使用第二患病组织类型的第二分数贡献确定所述生物体中第一器官的第二疾病的水平。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述M个组织类型中的第二个对应于第二患病组织类型，第二患病组织类型对应于第二器官的第二疾病，所述方法还包括：通过计算机系统，使用所述N个混合物的甲基化水平和所述M个组织类型的每一个的所述N个组织特异性甲基化水平，确定所述混合物中第二患病组织类型的第二分数贡献；和使用第二患病组织类型的第二分数贡献确定所述生物体中第二器官的第二疾病的水平。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述M个组织类型中的第二组织类型对应于第一器官的健康组织。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品来自第一器官或当所述生物样品离开所述生物体时穿过第一器官。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是尿，并且第一器官是膀胱。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是尿，并且第一器官是肾脏。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一疾病是肾小球肾炎或肾病综合征。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是唾液，并且第一器官是唾液腺。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一疾病是癌症。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是尿液样品，所述方法还包括：通过加入乙二胺四乙酸(EDTA)制备尿液样品。12.根据权利要求1所述的方法，还包括确定所述生物样品中无细胞DNA和细胞DNA的比例贡献。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述N个基因组位点包括具有比个体间差异的阈值量小的位点。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述M个组织类型包括肾、尿路上皮、中性粒细胞、B细胞和T细胞。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述N个基因组位点包括在正常尿路上皮的甲基化组中的位点。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述N个基因组位点包括正常尿路上皮的甲基化组和肿瘤甲基化组共有的位点。17.一种分析生物体的尿液样品的方法，所述尿液样品包括源自正常细胞和可能来自与癌症相关的细胞的DNA，其中所述尿液样品中的至少一些DNA是无细胞的，所述方法包括：对于多种大小的每种大小：测量所述尿液样品中与所述大小对应的DNA片段的量；基于多种大小的DNA片段的量计算第一参数的第一值，所述第一参数提供所述尿液样品中DNA片段的大小分布的统计测量，其中第一参数随着DNA片段的大小增加而增加；将第一值与参考值进行比较；和基于所述比较确定膀胱癌水平的分类。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述参考值从分别已知具有膀胱癌和/或不具有膀胱癌的样品确定。19.根据权利要求17所述的方法，其中：第一参数包括周期性指数，所述周期性指数使用所述大小分布中的多个峰值处的DNA片段的量和所述大小分布中的多个谷值处的DNA片段的量的差异计算，所述多个峰值以规则大小间隔存在，并且所述多个谷值以规则大小间隔偏离所述多个峰值存在。20.根据权利要求17所述的方法，其中确定膀胱癌水平的分类的步骤包括当所述第一值大于所述参考值时确定所述生物体具有膀胱癌。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述膀胱癌的水平包括膀胱癌的阶段。22.根据权利要求17所述的方法，其中所述参考值在手术以从所述生物体的膀胱移除肿瘤之前从所述生物体确定。23.一种分析来自生物体的肾脏的肾盂的尿液样品的方法，所述尿液样品包含DNA，其中至少一些DNA是无细胞的，所述方法包括：对于多种大小的每种大小：测量所述尿液样品中与所述大小对应的DNA片段的量；基于多种大小的DNA片段的量计算第一参数的第一值，所述第一参数提供所述尿液样品中DNA片段的大小分布的统计测量；将第一值与参考值进行比较；和基于所述比较确定所述肾脏中炎症水平的分类。24.根据权利要求23所述的方法，其中第一参数随着DNA片段大小的增加而增加。25.根据权利要求23所述的方法，其还包括：当第一值大于参考值时确定所述肾脏发炎。26.根据权利要求23所述的方法，其还包括：从所述肾脏的肾盂获得所述尿液样品。27.根据权利要求23所述的方法，其中：第一参数包括周期性指数，第一参数包括周期性指数，所述周期性指数使用所述大小分布中的多个峰值处的DNA片段的量和所述大小分布中的多个谷值处的DNA片段的量的差异计算，所述多个峰值以规则大小间隔存在，并且所述多个谷值以规则大小间隔偏离所述多个峰值存在。28.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一参数包括中值或具有阈值大小的DNA片段的比例。29.根据权利要求23所述的方法，其中所述参考值从已知所述生物体健康时的所述生物体确定。30.一种通过分析生物体的第一样品和血液样品，鉴定所述生物体的第一器官中的癌症的方法，所述第一样品和血液样品均包括源自正常细胞和可能来自与癌症相关的细胞的DNA，其中第一样品来自第一器官或当第一样品离开所述生物体时通过第一器官，并且不同于所述血液样品，并且其中第一样品和血液样品中的至少一些DNA是无细胞的，所述方法包括：分析来自第一样品和血液样品的多个DNA分子，其中分析DNA分子包括：鉴定DNA分子在所述生物体的基因组中的位置，并任选地确定DNA分子是否在一个或多个位点甲基化；对于所述生物体的多个染色体区域的每个染色体区域：通过以下方式确定对于第一样品和血液样品中的每一个，所述染色体区域是否表现出拷贝数异常或甲基化异常中的至少一种异常的分类：基于鉴定的位置从相应的样品中鉴定来自所述染色体区域的DNA分子的相应组，所述相应组包括位于所述染色体区域的多个基因座中的每一个的至少一个DNA分子；用计算机系统计算DNA分子的相应组的相应值，所述相应值限定所述相应组的DNA分子的性质，所述性质是拷贝数或甲基化水平中的至少一种；将相应值与参考值进行比较；基于分类为表现出第一样品的异常的染色体区域的第一量是否高于第一阈值，确定癌症的第一水平；基于分类为...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢煜明，赵慧君，陈君赐，江培勇，郑华哲，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81