【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、本公开提供了用于产生粘末端悬突的方法和组合物，其与已知方法相比是简单且廉价的。所述方法和组合物也可应用于液滴条形码化。本公开还提供了用于温度切换介导的可降解水凝胶珠的方法和组合物，其允许用于封装各种组分、凝胶化和溶解水凝胶珠的温和条件，并且与许多下游分析高度相容。本公开进一步提供了用于简单和独立于纯化的dna片段化和末端修复的方法和组合物。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本公开提供了制备和分析来自各种来源的dna的方法，组合物和装置。
2、在一个方面，本公开提供了用于在一步pcr反应中产生单链悬突的方法，所述方法包括：
3、使模板dna分子与第一正向引物、第一和第二反向引物以及热稳定性聚合酶接触；
4、其中所述第一反向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二反向引物的5’末端的一个或多个核苷酸碱基；
5、其中所述第二反向引物的5’末端的一个或多个核苷酸在一个或多个互补核苷酸处与模板dna分子退火，所述一个或多个互...
【技术保护点】
1.用于在一步PCR反应中产生单链悬突的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其还包括使所述模板DNA分子与第二正向引物接触，并扩增所述模板DNA以产生还在5’末端包含单链悬突的双链扩增子，其中第一正向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二正向引物的5’末端的一个或多个核苷酸碱基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一反向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二反向引物的5’末端的1至20个核苷酸碱基，和/或所述第一正向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二正向引物的5’末端的1至20个核苷酸碱基。
4.如前述权利要求中...
【技术特征摘要】
1.用于在一步pcr反应中产生单链悬突的方法，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其还包括使所述模板dna分子与第二正向引物接触，并扩增所述模板dna以产生还在5’末端包含单链悬突的双链扩增子，其中第一正向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二正向引物的5’末端的一个或多个核苷酸碱基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一反向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二反向引物的5’末端的1至20个核苷酸碱基，和/或所述第一正向引物包含在5’方向上延伸超过所述第二正向引物的5’末端的1至20个核苷酸碱基。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将包含所述悬突的扩增子与包含互补悬突的双链dna片段连接。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一反向引物和/或所述第一正向引物包含5’末端脱氧腺苷(da)。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二反向引物和/或所述第二正向引物包含5’末端磷酸化。
7.如权利要求4或5所述的方法，其包括扩增所述模板dna以产生在3’末端包含dt悬突的双链扩增子。
8.如权利要求7所述的方法，其还包括将包含dt悬突的扩增子与包含3’末端da悬突的双链dna片段连接。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述双链dna片段包含通过使模板dna分子与正向和反向引物以及添加3’末端da的聚合酶接触而产生的扩增子。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一正向引物包含连接到5’末端的能够用于纯化的分子。
11.如权利要求10所述的方法，其中用于纯化的分子是生物素。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物包含5’末端生物素分子。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述模板dna分子包含条形码序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述条形码序列包含侧翼为能与引物结合的序列的特有随机序列。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述条形码序列的长度为1-50个核苷酸或碱基对。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述第一正向引物和/或所述第一反向引物包含防止所述条形码dna自连接的间隔区。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述间隔区包括c3间隔区。
18.如权利要求13至17中任一项所述的方法，其中将所述包含条形码序列的模板dna分子、所述正向引物、所述第一和第二反向引物以及所述热稳定性聚合酶封装在液滴中。
19.如权利要求18所述的方法，其中将多个包含条形码序列的模板dna分子封装在多个单独的液滴中。
20.如权利要求13至19中任一项所述的方法，其中将1至100个包含条形码序列的模板dna分子封装在单一液滴中。
21.温度敏感性可降解水凝胶，其包含聚乙二醇硫醇(peg-sh)、酪胺和辣根过氧化物酶(hrp)。
22.如权利要求21所述的水凝胶，其中所述水凝胶在约2℃至8℃下为液体，并且在约16℃至37℃下交联。
23.如权利要求21或22所述的水凝胶，其还包含选自细菌dna、病毒dna、质粒dna、线粒体dna或染色体dna的dna。
24.如权利要求23所述的水凝胶，其中所述dna存在于一个或多个细胞中。
25.如权利要求24所述的水凝胶，其中所述一个或多个细胞选自原核细胞或真核细胞。
26.如权利要求21至25中任一项所述的水凝胶，其中通过使所述水凝胶与还原二硫键的还原剂接触来溶解所述水凝胶。
27.如权利要求26所述的水凝胶，其中所述还原剂选自dtt、三(2-羧乙基)膦(tcep)、2-巯基乙醇或以上的组合。
28.用于将细胞封装在水凝胶珠中的方法，其包括：
29.如权利要求28所述的方法，其中步骤(i)在约0℃至约25℃下进行，并且步骤iii)在约16℃只约37℃下进行。
30.如权利要求28所述的方法，其还包括裂解所述水凝胶珠内的细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其还包括溶解所述水凝胶珠并扩增存在于所述细胞中的dna，其中所述dna选自质粒dna、病毒dna、线粒体dna、染色体dna或基因组dna。
32.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中溶解所述水凝胶珠包括使所述液滴与还原剂接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述还原剂选自dtt、三(2-羧乙基)膦(tcep)、2-巯基乙醇或以上的组合。
34.如权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是原核细胞或真核细胞。
35.用于一步dna片段化和末端修复的方法，其包括
36.如权利要求24所述的方法，其中所述t7内切核酸酶i在所述第一温度下切割双链dna，并且所述聚合酶在所述第一温度下可逆地结合适配子。
37.如权利要求24所述的方法，其中所述t7内切核酸酶i在第二温度下失活，并且所述适配子在第二温度不结合所述聚合酶，从而活化所述聚合酶。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述聚合酶在所述片段化的dna上产生3’-da悬突。
39...
【专利技术属性】
技术研发人员：于君，何亦平，王国平，赵浏阳，曲富洋，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：
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