【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，涉及微生物转化生产二胺的方法，具体地说，涉及一种大肠杆菌工程菌催化环烷烃/环烷醇/二醇反应生产α,ω-二胺的方法。
技术介绍
1、脂肪族α,ω-二胺(da)是大宗化学品，主要用作聚酰胺塑料制造中的单体前体，在工程塑料、机械配件、纤维、薄膜和其他应用的制造中具有广泛的应用，然而目前da的合成方法是对环境有害的能量密集型多步骤化学反应。例如1,6-己二胺(hmd)每年大约生产1.2mt，是尼龙66合成中最重要的单体之一，尼龙66是纺织和塑料行业重要的聚酰胺，2019年全球尼龙66市场规模估计为162.9亿美元，预计从2019年到2027年每年增长6.5％。hmd主要是通过丁二烯氢氰化在高技术控制下合成的，但其存在使用剧毒氰化氢、选择性不理想和反应复杂的缺陷。为了克服这些缺陷，多年来人们一直在尝试通过更换有害试剂或/和改变原材料基础来寻找更环保的工艺，已经开发了一些避免使用氰化物并从容易获得的材料(例如，1,6-己二醇)作为底物的方法，但仍然存在诸如高反应温度、高压和高催化剂负载等限制，因此迫切需要开发绿色、安全的da合成路线。
2、生物生产方法反应条件温和，且有优异的选择性。迄今为止，仅一种从己二酸(aa)到hmd的生物催化途径有文献报道，是通过羧酸还原酶(car)和转氨酶(ta)催化两轮还原/胺化反应，该方法仅产生约3mm hmd，而且70％积累了中间体副产物6-氨基己酸(6-aca)。此外，尽管一些专利提出了用于hmd生物合成的各种非天然生物途径，但均没有后续的研究开发报道。因此，非常需要一种
技术实现思路
1、本课题组经过数年的探索，开发了一种一锅法微生物体内生物催化级联反应，借助基因工程将环烷烃生物转化为da。该研究包括用于生物催化路线设计的retrobiocat工具优化和利用、用于寻找合适酶的酶挖掘和用于有效途径组装的微生物群落构建，开发的基于微生物联合催化系统成功生产出了da比如hmd等，当使用环己醇chol和环己烷ch作为底物时，产物da浓度分别高达16.5mm和7.6mm，取得了目前报道的最高hmd生物合成产量，为高效、绿色的da生产提供了一条有前景的途径。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
2、一种微生物转化生产二胺(或称α,ω-二胺，da)的方法，包括如下步骤：
3、以α,ω-二醇(do)为原料，用大肠杆菌工程菌模块3催化反应，得到α,ω-二胺；或者
4、以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺；或者
5、以环烷烃为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺，其中
6、大肠杆菌工程菌模块3过表达醇脱氢酶chnd和转氨酶(ta)，简写为m3；
7、大肠杆菌工程菌模块2过表达醇脱氢酶adh、baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)、内酯酶(lac)、羧酸还原酶(car)、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)，并且表达内源性醛酮还原酶(akr)，简写为m2；
8、大肠杆菌工程菌模块1过表达p450酶，简写为m1。
9、上述α,ω-二胺可以是c6-c8的α,ω-二胺即1,6-己二胺、1,7-庚二胺或者1,8-辛二胺；相应地，所述环烷醇为环己醇、环庚醇或者环辛醇；所述环烷烃为环己烷、环庚烷或者环辛烷。
10、优选地，所述α,ω-二胺是1,6-己二胺(hmd)，所述环烷醇为环己醇(chol)，所述环烷烃为环己烷(ch)。
11、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块3中过表达的所述醇脱氢酶chnd编码基因序列为seq id no:1；所述转氨酶(ta)选自下组中的一种：cv，编码基因序列为seqid no:2，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3a；pp2159，编码基因序列为seq id no:3，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3b；sav2614，编码基因序列为seq id no:4，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3c；pak，编码基因序列为seq id no:5，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3d；或者spo3471，编码基因序列为seq id no:6，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3e。
12、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块2中过表达的所述醇脱氢酶adh编码基因序列为seq id no:7；所述baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)编码基因序列为seq idno:8；所述内酯酶(lac)编码基因序列为seq id no:9；所述羧酸还原酶(car)编码基因序列为seq id no:10；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)编码基因序列为seq id no:11。
13、由于醛酮还原酶(akr)是大肠杆菌内源性的，无需进行过表达。
14、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块1中过表达的所述p450酶是在专利文献cn111411128a和文献yu hl,et al.,bioamination of alkane with ammonium by anartificially designed multienzyme cascade.metabolic engineering.47,184-189(2018).中报道的p450bm319a12，编码基因序列为seq id no:12；或者是专利文献cn114836486a中报道的野生型细胞色素p450-bm3 wt(来源于巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、细胞色素突变体p450-bm3 f87g或者细胞色素p450pyrtm(来源于鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.hxn-200))、或者是salamanca,diego,et al."novel cyclohexanemonooxygenase from acidovorax sp.chx100."applied microbiology andbiotechnology.99 6889-6897(2015).中报道的细胞色素p450chx。
15、上述大肠杆菌工程菌模块3可以通过下述方法构建得到：将chnd基因和一种ta基因(选自cv、pp2159、sav2614、pak和spo3471)克隆到质粒petduet-1上，构建的质粒petduet-chnd-ta依次包含t7启动子、chnd基因、rbs位点和ta基因，命名为petduet-chnd-ta；然后将构建的质粒petduet-chnd-ta转化到大肠杆菌中，得到大肠杆菌工程菌。
16、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块2可以通过下述方法构建得到：
17、1)将adh基因、car基因、sfp基因和bvmo基因克隆到质粒prsfduet-1上，构建的质粒(prsfduet-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物转化生产二胺的方法，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α,ω-二胺是C6-C8的α,ω-二胺即1,6-己二胺、1,7-庚二胺或者1,8-辛二胺；相应地，所述环烷醇为环己醇、环庚醇或者环辛醇；所述环烷烃为环己烷、环庚烷或者环辛烷。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块3中过表达的所述醇脱氢酶ChnD编码基因序列为SEQ ID NO:1；所述转氨酶(TA)选自下组中的一种：CV，编码基因序列为SEQ ID NO:2；PP2159，编码基因序列为SEQ ID NO:3；SAV2614，编码基因序列为SEQID NO:4；PAK，编码基因序列为SEQ ID NO:5；SPO3471，编码基因序列为SEQ ID NO:6。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块2中过表达的所述醇脱氢酶ADH编码基因序列为SEQ ID NO:7；所述Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)编码基因序列为SEQ ID NO:8；所述内酯酶(Lac)编码基因序列为SEQ ID NO:9
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块1中过表达的所述P450酶是在专利文献CN111411128A和文献Yu HL,et al.,Bioamination of alkane withammonium by an artificially designed multienzyme cascade.MetabolicEngineering.47,184-189(2018).中报道的P450BM319A12，编码基因序列为SEQ ID NO:12；或者是专利文献CN114836486A中报道的野生型细胞色素P450-BM3 WT、细胞色素突变体P450-BM3F87G或者细胞色素P450pyrTM；或者是Salamanca,Diego,et al."Novelcyclohexane monooxygenase from Acidovorax sp.CHX100."Applied microbiology andbiotechnology.996889-6897(2015).中报道的细胞色素P450CHX。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块3通过下述方法构建得到：将ChnD基因和一种TA基因(选自CV、PP2159、SAV2614、PAK和SPO3471)克隆到质粒pETDuet-1上，构建的质粒pETDuet-ChnD-TA依次包含T7启动子、ChnD基因、RBS位点和TA基因，命名为pETDuet-ChnD-TA；然后将构建的质粒pETDuet-ChnD-TA转化到大肠杆菌中，得到大肠杆菌工程菌。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块2通过下述方法构建得到：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，根据质粒(pRSFDuet-CAR，SFP，BVMO，ADH)中T7启动子下游各基因的顺序排列，大肠杆菌工程菌模块2分别命名如下：
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块1通过下述方法构建得到：将P450酶基因克隆到表达载体pRSF-Duet(购自Novagen)上相应位点，酶切位点为NdeI和BamHI，将P450酶基因的表达置于T7启动子和lacI阻遏基因的控制下，获得重组质粒pRSF-Duet-P450；将质粒pRSF-Duet-P450转化到大肠杆菌中，得到表达P450酶的大肠杆菌工程菌。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法的生物催化级联反应、或者一锅一步法，其中，
...【技术特征摘要】
1.一种微生物转化生产二胺的方法，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α,ω-二胺是c6-c8的α,ω-二胺即1,6-己二胺、1,7-庚二胺或者1,8-辛二胺；相应地，所述环烷醇为环己醇、环庚醇或者环辛醇；所述环烷烃为环己烷、环庚烷或者环辛烷。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块3中过表达的所述醇脱氢酶chnd编码基因序列为seq id no:1；所述转氨酶(ta)选自下组中的一种：cv，编码基因序列为seq id no:2；pp2159，编码基因序列为seq id no:3；sav2614，编码基因序列为seqid no:4；pak，编码基因序列为seq id no:5；spo3471，编码基因序列为seq id no:6。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块2中过表达的所述醇脱氢酶adh编码基因序列为seq id no:7；所述baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)编码基因序列为seq id no:8；所述内酯酶(lac)编码基因序列为seq id no:9；所述羧酸还原酶(car)编码基因序列为seq id no:10；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)编码基因序列为seqid no:11。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，大肠杆菌工程菌模块1中过表达的所述p450酶是在专利文献cn111411128a和文献yu hl,et al.,bioamination of alkane withammonium by an artificially designed multienzyme cascade.metabolicengineering.47,184-189(2018).中报道的p450bm319a12，编码基因序列为seq id no:12；或者是专利文献cn114836486a中报道的野生型细胞色素p450-bm3 wt、细...
【专利技术属性】
技术研发人员：李爱涛，张中伟，李倩，赵晶，方淋，王斐，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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