贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种贵州地方黄牛IGF‑1基因多态筛选方法。本发明专利技术通过贵州地方黄牛IGF‑1基因多态筛选方法，成功筛选出3个SNP位点，分别为Intron2‑A5123G、Intron3‑C56464A、Exon3‑G56419A。为探讨IGF‑1基因对贵州本地牛种生长发育的调节作用奠定基础，同时也为贵州地方黄牛的从分子方面选种培育提供理论依据，避免在筛选贵州地方黄牛IGF‑1基因多态性摸索时繁琐的步骤。

Screening Method of IGF-1 Gene Polymorphism in Guizhou Local Yellow Cattle

【技术实现步骤摘要】
贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法
本专利技术属于生物
，尤其是一种贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法
技术介绍
胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor,IGF-1)是胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)家族成员之一，胰岛素样生长因子家族主要包括胰岛素样生长因子1和2(IGF-1及IGF-2)、胰岛素样生长因子受体(IGF-1R及IGF-2R)和胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)，其中IGF-1对机体生长发育中占主导作用。IGF-1是由肝脏合成，并以结合蛋白的形式存在于血液中，是生长激素诱导骨生长的主要介质，能调节成骨细胞功能、参与骨重建。目前，关于贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选尚未见文献报道。关岭牛、思南牛、威宁牛、黎平牛属于贵州地方优良特色品种，均具有耐粗饲、适应性强、肉质优良等特点，但也存在体格偏小、生长速度缓慢等问题，故筛选出与四个牛种相关的IGF-1基因多态位点，可寻找与贵州地方牛生长性状关联的特征标记，从而为探讨IGF-1基因对贵州本地牛种生长发育的调节作用奠定基础，同时也为保种选育和开发利用提供参考依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是：从IGF-1基因中筛选出与贵州地方黄牛生长发育性状相关的分子遗传标记，对揭示贵州地方黄牛生长发育的分子调控机制具有重要的研究意义。本专利技术是这样实现的：贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法，包括如下步骤：分别从贵州省关岭县、思南县、威宁县、黎平县采集牛血样，共214头(关岭牛82头,思南和威宁各50头,黎平32头，同一年龄阶段，健康无疾病)，利用血液基因组提取试剂盒进行血液DNA提取，将提取合格的DNA作为模板进行IGF-1基因引物PCR扩增而获得目的片段，最后将获得的目的片段采用直接测序检测贵州地方黄牛IGF-1基因多态性。所述的引物包括上游引物IGF-1F1、IGF-1F2、IGF-1F3、IGF-1F4及下游引物IGF-1R1、IGF-1R2、IGF-1R3、IGF-1R4：上游引物序列为：IGF-1F1：5’-ACGCCCGGTAGAAAGTTAA-3’；IGF-1F2：5’-GACCCAGGAGGAAGATGA-3’；IGF-1F3：5’-CAGGAGTTGTTGGAGGAGC-3’；IGF-1F4：5’-GACCACCTGTTCTCAATG-3’下游引物序列为：IGF-1R1：5’-CAAGCCCTGAAGAAGTGGA-3’；IGF-1R2：5’-GCAGAATAGTTGCGAGAAA-3’；IGF-1R3：5’-CCAGAAGTCTATGAGGGTATGA-3’；IGF-1R4：5’-TCTTAGTCTTTCTTTCCTCC-3’所述的IGF-1基因引物设计：采用NCBI数据库中牛IGF-1基因的参考序列(GenBank登录号:NC_037332.1)，利用Premier5.0软件对牛IGF-1基因第1、第2、第3、第4外显子及部分内含子设计特异性引物，选取的引物综合评分均95以上，上下游引物温度相差2℃以内，GC含量55％-66％，碱基序列长度18-23bp。所诉的PCR扩增的反应总体系20ul:上、下游引物各1.5μL(浓度10pmol/μL)，2×EsTaqMasterMix10μL，DNA模板2μL，ddH2O5μL。PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，退火45s，72℃延伸30s，72℃终延伸5min，35个循环。PCR产物用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪观察电泳结果并保存。所述的IGF-1多态检测：将PCR扩增获得的目的片段进行直接测序，通过与NCBI数据库中牛IGF-1基因原序列对比，在贵州地方黄牛中发现3个多态位点，分别位于第2内含子(Intron2-A5123G)、第3内含子(Intron3-C56464A)、第3外显子(Exon3-G56419A)。由于采用了以上技术方案，本专利技术通过贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法，成功找到3个突变位点，即Intron2-A5123G、Intron3-C56464A、Exon3-G56419A，为探讨IGF-1基因对贵州本地牛种生长发育的调节作用奠定基础，同时也为贵州地方黄牛的从分子方面选种培育提供理论依据，避免在筛选贵州地方黄牛IGF-1基因多态性摸索时繁琐的步骤。附图说明：图1：贵州地方黄牛血液基因组DNA提取检测结果；图2：贵州地方黄牛IGF-1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；图3：贵州地方黄牛IGF-1基因PCR产物测序峰图及SNP位点；注:GL:关岭牛；SN:思南牛；WN:威宁牛；LP:黎平牛。具体实施方式本专利技术的实施例：一种贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法1.贵州地方黄牛血液DNA提取分别从贵州省关岭县、思南县、威宁县、黎平县采集牛血样，共214头(关岭牛82头、思南和威宁各50头，黎平32头)，提取DNA方法参照上海生工生物工程股份有限公司的血液基因组提取试剂盒说明书进行，将提取得到的DNA用微量紫外分光光度计检测其浓度及纯度，用浓度为1％琼脂糖凝胶检测其完整性，结果如图1所示，条带明亮且集中，无明显拖尾，说明提取DNA纯度效果好，可用于下一步实验。2.贵州地方黄牛IGF-1基因引物序列设计采用NCBI数据库中牛IGF-1基因的参考序列(GenBank登录号:NC_037332.1)，利用Premier5.0软件对牛IGF-1基因第1、第2、第3、第4外显子及部分内含子设计特异性引物(表1)。选取的引物综合评分均95以上，上下游引物温度相差2℃以内，GC含量55％-66％，碱基序列长度18-23bp，引物均由上海生工生物工程公司进行合成。表1IGF-1基因引物序列及参数3.贵州地方黄牛IGF-1基因PCR扩增引物片段PCR扩增体系：总共20μL：2×EsTaqMasterMix10μL，DNA模板2μL，上、下游引物各1.5μL(10pmol/μL)，ddH2O5μL。PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，变退火45s，72℃延伸30s，72℃终延伸5min，35个循环。将最后获得的PCR产物取5μLPCR产物用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪观察电泳结果(图2)，每个目的片段明亮且无杂带，特异性较好，可用作测序。剩余15μLPCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。4.测序结果比对及验证将得到的PCR产物直接送到上海生工生物公司进行单向测序，应用DNAStar软件中SeqManⅡ程序对测序峰图进行分析比对，并与NCBI上发布的牛序列进行对比分析，发现贵州地方黄牛IGF-1基因序列第5123、56464、56419位均出现双峰且发生碱基突变，根据其突变位置，分别命名为Intron2-A5123G、Intron3-C56464A、Exon3-G56419A(图3)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种贵州地方黄牛IGF‑1基因多态筛选方法，其特征在于：收集贵州省内4个以上不同地区的贵州地方黄牛的牛血样，利用血液基因组提取试剂盒进行血液DNA提取，将提取合格的DNA作为模板进行IGF‑1基因引物PCR扩增而获得目的片段，最后将扩增获得的目的片段采用直接测序检测，找出其中的多态位点。

【技术特征摘要】
1.一种贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法，其特征在于：收集贵州省内4个以上不同地区的贵州地方黄牛的牛血样，利用血液基因组提取试剂盒进行血液DNA提取，将提取合格的DNA作为模板进行IGF-1基因引物PCR扩增而获得目的片段，最后将扩增获得的目的片段采用直接测序检测，找出其中的多态位点。2.根据权利要求1所述的贵州地方黄牛IGF-1基因多态筛选方法，其特征在于：所述的PCR扩增采用的引物包括上游引物IGF-1F1、IGF-1F2、IGF-1F3、IGF-1F4及下游引物IGF-1R1、IGF-1R2、IGF-1R3、IGF-1R4：上游引物序列为：IGF-1F1：5’-ACGCCCGGTAGAAAGTTAA-3’；IGF-1F2：5’-GACCCAGGAGGAAGATGA-3’；IGF-1F3：5’-CAGGAGTTGTTGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥，吴雨，陈伟，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52