本发明专利技术提供了一种血浆DNA的建库方法和建库试剂盒。其中，该建库方法包括：对血浆DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；采用带有唯一标签序列的接头对修复DNA依次进行接头连接和PCR扩增，得到血浆DNA的测序文库。通过采用带有唯一标签序列的接头对修复加A后的血浆DNA进行接头连接进而构建成血浆DNA的测序文库，这样形成的文库便于在后期对测序数据分析的时候，根据唯一标签序列将建库扩增或测序扩增所产生的重复，与血浆DNA中真实的重复片段区分出来，进而去除扩增重复而保留血浆碎片DNA本身存在的重复，使得来源于血浆DNA的有效数据量得以提升，从而一定程度上提高了血浆DNA的建库效率。
Method and kit for library construction of plasma DNA
【技术实现步骤摘要】
血浆DNA的建库方法和建库试剂盒
本专利技术涉及血浆DNA建库领域，具体而言，涉及一种血浆DNA的建库方法和建库试剂盒。
技术介绍
随着技术进步和人们对肿瘤和遗传病认识的深入，传统技术已经不能满足精准诊断的需求。精准诊断越来越依赖二代测序技术解决问题，二代技术也不断进步，测序通量越来越多，测序成本越来越低。目前市场主流二代测序仪主要有三家公司，分别是Illumina各型号测序仪，华大智造(MGI)测序仪和life公司的测序仪。Illumina的测序仪和华大智造的测序仪建库过程都是依赖T-A克隆的方式建库，区别在于Illumina是Y型接头，华大智造中间鼓泡型互补接头，这两种接头都能充分利用连接产物。Life的接头是平端连接，连接产物只有1/2模板是被测序仪测序，同时Life的测序仪对连续的碱基测序质量不高，一些精确应用受到限制。外周血中的血浆是血液的一部分，血液经过低速离心可以分成三部分，主要部分是上层血浆和下层红细胞，中间是白细胞层。基因组DNA主要集中在白细胞中，血浆中含有碎片DNA，DNA碎片是体内细胞凋亡的代谢产物，DNA碎片的长度是缠绕核小体的核酸片段长度及倍数，说明DNA碎片的产生是体内正常的代谢机制。血浆中碎片DNA的种类和数量与体内生长活性中心高度相关，如孕妇和肿瘤患者。在1997年，卢煜明在孕妇的母体中血浆中发现有胎儿的碎片DNA的存在(LoYMD,etal.1997)，得益于二代测序技术的发展，到2008年，卢煜明团队利用母体静脉血中胎儿碎片DNA检测21号、18号和13号染色体三体，这个技术的出现做到真正的无创产前筛查胎儿三体，替代了以前及其不准确的血清学筛查(RossaW.K.Chiu,etal.2008)。在不同的癌症病人中陆续被发现血浆中的碎片DNA含有肿瘤组织细胞的全部基因组变异信息(HeidiSchwarzenbachetal.2011)，检测肿瘤病人的外周血血浆碎片DNA就能检测出病人肿瘤细胞的信息有很大的好处，第一点是，无创，不需要受限于病人做手术取样，第二点，不受时间限制，可以做到对肿瘤病人定期病情检测和用药评估，真正做到精准及时诊断。目前的二代测序仪的能力完全可以解决更多的精准诊断问题，无创三体筛查只是初级应用，大部分的出生缺陷没有得到有效筛查控制；肿瘤患者的精准诊断和病情监控也完全可以通过无创外周血的血浆碎片DNA捕获测序进行。阻碍这些发展的两个核心问题，一个是血浆DNA在建库过程中利用率低，进而使得建库效率低的问题，第二个是分析的准确性问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种血浆DNA的建库方法和建库试剂盒，以解决现有技术中的血浆建库效率低的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种基于MGI测序平台的血浆DNA的建库方法，该建库方法包括：对血浆DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；采用带有唯一标签序列的接头对修复DNA依次进行接头连接和PCR扩增，得到血浆DNA的测序文库。进一步地，带有唯一标签序列的接头采用A1所示的第一Y接头和B1所示的第二Y接头的混合接头；A1：第一Y接头B1:第二Y接头其中，N为A、T、C或G，第一Y接头中的NNNNN序列与第二Y接头中的NNNNNN序列均代表唯一标签序列；优选地，唯一标签序列包括下表1所示的16个第一Y接头的5bp标签序列和16个第二Y接头的6bp标签序列：表1：接头序号5bp标签序列接头序号6bp标签序列MGI-5bp-15'Phos-GCTAG-3'MGI-6bp-15'Phos-GACGAT-3'MGI-5bp-25'Phos-GAGCA-3'MGI-6bp-25'Phos-GCTCTT-3'MGI-5bp-35'Phos-AGCGT-3'MGI-6bp-35'Phos-CGGAAT-3'MGI-5bp-45'Phos-CTCCA-3'MGI-6bp-45'Phos-GCATGA-3'MGI-5bp-55'Phos-TGGAC-3'MGI-6bp-55'Phos-CATCAC-3'MGI-5bp-65'Phos-CAAGC-3'MGI-6bp-65'Phos-GACATC-3'MGI-5bp-75'Phos-TCGTG-3'MGI-6bp-75'Phos-CTAGTC-3'MGI-5bp-85'Phos-GTACG-3'MGI-6bp-85'Phos-CGATCG-3'MGI-5bp-95'Phos-CGAGT-3'MGI-6bp-95'Phos-CATTGC-3'MGI-5bp-105'Phos-GCACT-3'MGI-6bp-105'Phos-CTGATG-3'MGI-5bp-115'Phos-TACCG-3'MGI-6bp-115'Phos-CAACTG-3'MGI-5bp-125'Phos-GTCAG-3'MGI-6bp-125'Phos-CTCTGT-3'MGI-5bp-135'Phos-GACTC-3'MGI-6bp-135'Phos-GCCTAT-3'MGI-5bp-145'Phos-TGTCC-3'MGI-6bp-145'Phos-GCCTTA-3'MGI-5bp-155'Phos-ACCGA-3'MGI-6bp-155'Phos-GCGTAA-3'MGI-5bp-165'Phos-AGGGA-3'MGI-6bp-165'Phos-GTAACC-3'。进一步地，带有唯一标签序列的接头采用A2所示的第一泡状接头和B2所示的第二泡状接头的混合接头；A2：第一泡状接头B2：第二泡状接头其中，N为A、T、C或G，S表示G或C，第一泡状接头中的NNN序列与第二泡状接头中的SNNN序列均代表唯一标签序列；优选地，唯一标签序列包括下表2所示的第一泡状接头的3bp标签序列和第二泡状接头的S+3bp标签序列：表2：进一步地，对末端修复后的血浆DNA进行接头连接后，PCR扩增，得到血浆DNA的测序文库的步骤包括：对接头连接后的血浆DNA进行PCR扩增，得到线性文库；对线性文库进行连接环化，得到血浆DNA的测序文库。进一步地，对线性文库进行连接环化的步骤中，采用成环陪伴序列以及TaqDNA连接酶进行连接环化；优选地，连接环化进行1～5次。进一步地，对血浆DNA进行末端修复及加A的步骤中，采用末端修酶进行末端修复，修复酶包括T4DNA聚合酶和Kelnow酶，其中，在单个反应中，T4DNA聚合酶的用量为1U～3U，优选为1U～1.5U。根据本专利技术的另一方面，提供了一种基于MGI测序平台的血浆DNA的建库试剂盒，试剂盒包括带有唯一标签序列的接头。进一步地，带有唯一标签序列的接头为A1所示的第一Y接头和B1所示的第二Y接头的混合接头；A1：第一Y接头B1：第二Y接头其中，N为A、T、C或G，第一Y接头中的NNNNN序列与第二Y接头中的NNNNNN序列均代表唯一标签序列；优选地，唯一标签序列包括表1所示的16个第一Y接头的5bp标签序列和16个第二Y接头的6bp标签序列。进一步地，带有唯一标签序列的接头采用A2所示的第一泡状接头和B2所示的第二泡状接头的混合接头；A2：第一泡状接头B2：第二泡状接头其中，N为A、T、C或G，S表示G或C，第一泡状接头中的NNN序列与第二泡状接头中的SNNN序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于MGI测序平台的血浆DNA的建库方法，所述建库方法包括：对血浆DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；采用带有唯一标签序列的接头对所述修复DNA依次进行接头连接和PCR扩增，得到所述血浆DNA的测序文库。
【技术特征摘要】
1.一种基于MGI测序平台的血浆DNA的建库方法，所述建库方法包括：对血浆DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；采用带有唯一标签序列的接头对所述修复DNA依次进行接头连接和PCR扩增，得到所述血浆DNA的测序文库。2.根据权利要求1所述的建库方法，所述带有唯一标签序列的接头采用A1所示的第一Y接头和B1所示的第二Y接头的混合接头；A1：第一Y接头B1：第二Y接头其中，N为A、T、C或G，所述第一Y接头中的NNNNN序列与所述第二Y接头中的NNNNNN序列均代表所述唯一标签序列；优选地，所述唯一标签序列包括下表1所示的16个所述第一Y接头的5bp标签序列和16个所述第二Y接头的6bp标签序列：表1：接头序号5bp标签序列接头序号6bp标签序列MGI-5bp-15'Phos-GCTAG-3'MGI-6bp-15'Phos-GACGAT-3'MGI-5bp-25'Phos-GAGCA-3'MGI-6bp-25'Phos-GCTCTT-3'MGI-5bp-35'Phos-AGCGT-3'MGI-6bp-35'Phos-CGGAAT-3'MGI-5bp-45'Phos-CTCCA-3'MGI-6bp-45'Phos-GCATGA-3'MGI-5bp-55'Phos-TGGAC-3'MGI-6bp-55'Phos-CATCAC-3'MGI-5bp-65'Phos-CAAGC-3'MGI-6bp-65'Phos-GACATC-3'MGI-5bp-75'Phos-TCGTG-3'MGI-6bp-75'Phos-CTAGTC-3'MGI-5bp-85'Phos-GTACG-3'MGI-6bp-85'Phos-CGATCG-3'MGI-5bp-95'Phos-CGAGT-3'MGI-6bp-95'Phos-CATTGC-3'MGI-5bp-105'Phos-GCACT-3'MGI-6bp-105'Phos-CTGATG-3'MGI-5bp-115'Phos-TACCG-3'MGI-6bp-115'Phos-CAACTG-3'MGI-5bp-125'Phos-GTCAG-3'MGI-6bp-125'Phos-CTCTGT-3'MGI-5bp-135'Phos-GACTC-3'MGI-6bp-135'Phos-GCCTAT-3'MGI-5bp-145'Phos-TGTCC-3'MGI-6bp-145'Phos-GCCTTA-3'MGI-5bp-155'Phos-ACCGA-3'MGI-6bp-155'Phos-...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐守运，曲艳，汪彪，胡玉刚，郑文莉，吴强，
申请(专利权)人：纳昂达南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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