【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及dna甲基化检测领域，具体而言，涉及一种dna甲基化水平的检测方法及应用。
技术介绍
1、甲基化dna指5-甲基胞嘧啶（5mc），它是在dna甲基转移酶（dnmt）的作用下将甲基基团添加到胞嘧啶的5’c位置上形成的。由于基因序列没有改变，pcr或测序无法准确测出甲基化的相关信息。目前最常用的是重亚硫酸盐转化法（bisμlfite conversion，bsconversion），即利用重亚硫酸氢盐使dna中未发生甲基化的胞嘧啶（c）脱氨基转变成尿嘧啶（u），而甲基化的胞嘧啶保持不变，最后通过设计引物进行pcr检测或高通量测序直接测得序列信息，与参考基因组进行对比后，就可以判断cpg位点的甲基化水平。bs转化的常用技术包括：甲基化特异性pcr（methylation-specific pcr，msp）、定量甲基化特异性pcr（quantitative methylation-specific pcr，qmsp）、全基因组重亚硫酸盐测序（whole-genome bisμlfite sequencing，wgbs）、简化表观重亚硫酸盐测序（reducedrepresentation bisμlfite sequencing，rrbs）。
2、基于bs转化的方法中，msp仅能对某些位点的进行甲基化水平的定性分析，qmsp虽可以对位点的甲基化水平定量，但是不管是msp还是qmsp，所针对的位点数极少，仅能对引物或探针上的cpg位点进行检测，可提供的甲基化信息太少，通量较少，限制了早筛检测的准确性和敏感性。>
3、bs-seq不管是wgbs还是rrbs，由于重亚硫酸盐会造成dna的损伤和降解，造成dna片段化和丢失，建库转化率极低。尤其早筛诊断的液体活检cfdna的含量较少，bs转化后几乎无法获得可用甲基化信息。此外，bs文库还表现出明显的gc偏向性，并过度集中在甲基化的区域。
4、neb公司（new england biolabs）成功开发了一种基于酶学转化、能同时检测5mc和5hmc的新方法，nebnext酶学转化法甲基化建库试剂盒 (enzymatic methyl-seq，em-seq)。em-seq利用酶促转化来取代重亚硫酸氢盐转化，能够最大限度减少dna损伤。bs-seq和em-seq都是基于转化原理，通过测序后比对基因组，统计转化后的c→t（互补链g→a）数量，与未转化的c数量进行对比，从而获得位点的甲基化水平。
5、em-seq虽然减少了dna损伤，但是建库时间较长、实验步骤繁琐、多次纯化会导致信息丢失。不管是bs-seq还是em-seq都是会导致非甲基化位点的碱基转变（c→t），因此无法同时检测基因组的突变信息，并且对于突变导致的c→t与转化导致的c→t只能通过生信方法匹配正负链的方式检测，无法准确区分，造成假阳性。
6、甲基化限制性内切酶（methylation sensitive restriction enzymes，msre）是一类对其识别位点中含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶。msre能够针对酶切位点进行切割，如酶切位点中含有一个甲基化碱基则无法切割dna。根据msre的甲基化敏感特性，已有相关检测甲基化水平的相关技术：甲基化敏感性限制性内切酶定量pcr（msre-qpcr）和甲基化敏感性限制性内切酶测序技术（msre-seq）。msre-qpcr通过提取dna，使用msre对dna进行酶切，通过设计相应引物，以qpcr的方式根据ct值获取酶切后的拷贝数，从而推算甲基化水平。msre-seq则是msre对基因组dna酶切后，利用酶切获得的粘性末端将测序接头连接到酶切后产物上，进行全基因组层面的ngs测序，从而推算甲基化信息（doi: 10.1038/s41598-023-40611-w），但仍存在漏检以及偏好性的问题。
7、msre-qpcr仅能针对少量位点进行检测，与msp-qpcr缺点类似，极大地限制了早筛检测的可靠性。msre-seq缺少成熟的位点筛选、建库和突变共检测的标准流程，尚未有可靠的甲基化水平分析方法。msre-qpcr和msre-seq均难以满足对于大量特定位点进行dna甲基化水平检测的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种dna甲基化水平的检测方法及应用，以解决现有技术中的难以准确检测大量潜在dna甲基化位点的甲基化水平的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种dna甲基化水平的检测方法，该检测方法包括：a）在样本dna的末端连接接头，获得接头连接dna；b）将接头连接dna平均分为接头连接dna1和接头连接dna2，利用甲基化敏感限制性内切酶对接头连接dna1进行酶切，获得甲基化酶切片段；c）分别对甲基化酶切片段和接头连接dna2进行pcr扩增，相应地获得甲基化酶切-扩增文库和阴性对照-扩增文库；d）分别对甲基化酶切-扩增文库和阴性对照-扩增文库中的目标片段进行捕获，分别获得捕获阳性文库和捕获阴性文库； e）对捕获阳性文库和捕获阴性文库分别进行pcr扩增和上机测序，分析测序结果获得样本dna的dna甲基化水平。
3、进一步地，目标片段包括甲基化水平检测区域和均一化区域；优选地，甲基化水平检测区域为样本dna中含有能够被甲基化敏感限制性内切酶酶切的位置的dna片段；优选地，均一化区域为样本dna中不含有能够被甲基化敏感限制性内切酶酶切的位置的dna片段。
4、进一步地，d）包括：利用捕获探针对目标片段进行捕获，或对利用能够与接头特异性结合的引物进行pcr实现对目标片段的捕获，分别获得捕获阳性文库和捕获阴性文库。
5、进一步地，捕获探针包括msre探针和均一化探针；其中，msre探针用于靶向捕获甲基化水平检测区域， 均一化探针用于靶向捕获均一化区域。
6、进一步地，甲基化水平检测区域位于样本dna的启动子区域的cpg富集区；优选地，甲基化水平检测区域的长度为100-250 bp，甲基化水平检测区域及前后各延伸100bp范围内含有至少2个能够被甲基化敏感限制性内切酶酶切的msre位点；优选地，均一化区域的gc含量为40%-60%，长度为50-200 bp，均一化区域及前后各延伸100 bp范围内不含有能够被甲基化敏感限制性内切酶酶切的msre位点。
7、进一步地，检测方法中的e）中的分析测序结果包括：e1）从测序结果中获得捕获阳性文库中每个msre位点的平均测序深度κmsre；从测序结果中获得捕获阳性文库中每个均一化区域的平均测序深度ζmsre，计算所有均一化区域的测序深度平均值；计算每个msre位点的相对深度；与dna甲基化水平呈正相关；优选地，检测方法中的e）中的分析测序结果还包括：e2）从测序结果中获得捕获阴性文库中每个msre位点的平均测序深度κck；从测序结果中获得捕获阳性文库中每个均一化区域的平均测序深度ζck，计算所有均一化区域的测序深度平均值；计算每个msre位点的相对深本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA甲基化水平的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述目标片段包括甲基化水平检测区域和均一化区域；
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述d）包括：利用捕获探针对所述目标片段进行捕获，或对利用能够与所述接头特异性结合的引物进行PCR实现对所述目标片段的捕获，分别获得捕获阳性文库和捕获阴性文库。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述捕获探针包括MSRE探针和均一化探针；
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化水平检测区域位于所述样本DNA的启动子区域的CpG富集区。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化水平检测区域的长度为100-250 bp，所述甲基化水平检测区域及前后各延伸100bp范围内含有至少2个能够被所述甲基化敏感限制性内切酶酶切的MSRE位点。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述均一化区域的GC含量为40%-60%，长度为50-200 bp，所述均一化区域及
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中的e）中的所述分析测序结果包括：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中的e）中的所述分析测序结果还包括：
10.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述样本DNA中还含有无甲基化修饰的DNA；
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述酶切效率评估区域包括无甲基化修饰的DNA的酶切区域和无甲基化修饰的DNA的阴性对照区域；
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述无甲基化修饰的DNA的酶切区域的长度为100-250 bp，含有至少2个能够被所述甲基化敏感限制性内切酶酶切的MSRE位点。
13.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述无甲基化修饰的DNA的阴性对照区域的GC含量为40%-60%，长度为80-200 bp，所述无甲基化修饰的DNA的阴性对照区域及前后各延伸100 bp范围内不含有能够被所述甲基化敏感限制性内切酶酶切的MSRE位点。
14.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述无甲基化修饰的DNA包括λDNA。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的检测方法，其特征在于，在获得所述样本DNA的DNA甲基化水平前，分析测序结果获得酶切效率；
16.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化敏感限制性内切酶包括HpaI、HpaII、HhaI或AciI；
17.根据权利要求3、4、10、11、12、13或14中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述捕获探针为生物素修饰的探针。
18.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，所述捕获探针还包括突变检测探针，所述突变检测探针包括用于检测碱基替换、碱基插入、碱基缺失、染色体拷贝数变异分析、微卫星不稳定性或融合基因的探针。
19.根据权利要求18所述的检测方法，其特征在于，所述突变检测探针的靶向区域的前后各100bp范围内不含有能够被所述甲基化敏感限制性内切酶酶切的MSRE位点。
20.权利要求1-19中任一项所述的DNA甲基化水平的检测方法在检测样本DNA的甲基化水平中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种dna甲基化水平的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述目标片段包括甲基化水平检测区域和均一化区域；
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述d）包括：利用捕获探针对所述目标片段进行捕获，或对利用能够与所述接头特异性结合的引物进行pcr实现对所述目标片段的捕获，分别获得捕获阳性文库和捕获阴性文库。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述捕获探针包括msre探针和均一化探针；
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化水平检测区域位于所述样本dna的启动子区域的cpg富集区。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化水平检测区域的长度为100-250 bp，所述甲基化水平检测区域及前后各延伸100bp范围内含有至少2个能够被所述甲基化敏感限制性内切酶酶切的msre位点。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述均一化区域的gc含量为40%-60%，长度为50-200 bp，所述均一化区域及前后各延伸100 bp范围内不含有能够被所述甲基化敏感限制性内切酶酶切的msre位点。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中的e）中的所述分析测序结果包括：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中的e）中的所述分析测序结果还包括：
10.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述样本dna中还含有无甲基化修饰的dna；
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述酶切效率评估区域包括无甲基化修饰的dna的酶切区域和无...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪彪，余丽萍，吴强，
申请(专利权)人：纳昂达南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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