【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物智能传感器，涉及一种实时检测活细胞内lncrna表达水平的方法及其应用。
技术介绍
1、长链非编码rna（lncrnas）是一类长度大于200个核苷酸的非蛋白编码rna分子。最初，lncrna被认为是没有生物学意义的转录“噪声”。最近，由于lncrna的重要性在生物过程如发育、分化和病理中被发现，其重要性正在被重新评估。在细胞基因表达调控方面，lncrna能够影响基因的转录过程，通过与dna、mrna或蛋白质相互作用来调控基因表达。这种调控包括启动子甲基化、染色质重塑和转录因子调控等，使lncrna成为基因表达的重要调节器。同时lncrna在疾病发展中也同样起到重要的作用，许多研究表明，lncrna在多种癌症中的异常表达与肿瘤的发展和转移有关。一些lncrna被鉴定为潜在的癌症标志物，可以用于诊断、预后和治疗。同样在心血管疾病和神经系统疾病中，lncrna也被作为潜在的治疗靶点或生物标志物。最后，lncrna的种类多样性和功能多样性在生物进化中起着重要作用。它们可以促进新基因的演化，参与物种特异性的生物学过程，以及适应环境变化。研究lncrna在不同物种之间的演化有助于我们更好地理解生命的多样性和演化过程。
2、传统的研究lncrna方法主要是基于rna序列检测的方法和细胞内定位的方法。例如，rna印迹是一种经典的rna检测方法，可以定量测定lncrna的存在和含量。但是这种方法需要大量rna样本，并且对lncrna的长度有限制。它也相对耗时且需要较复杂的实验操作。rt-pcr作为一种高灵敏度和高特
3、随着纳米科技和生物医学技术的不断演进，不同类型的纳米材料，因其特殊的结构和独特性能，正在被引入生物医学领域，以实现多种特殊应用。在其中，高斜率的纳米针阵列以其独特的形态和生物相容性，被越来越多的用于在活细胞内进行分子原位提取和检测。纳米针的尖锐度和微小尺寸使其可以轻柔地穿透细胞膜并与细胞内部结构进行亚细胞级的交互。这种无损性交互可用于分子提取、药物递送、细胞成像以及其他生物医学研究和应用中。通过纳米针技术，研究人员能够更精细地探索细胞的内部功能，而不会对它们的生存和活动产生显著负面影响。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种实时检测活细胞内lncrna表达水平的方法及其应用。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种实时检测活细胞内lncrna表达水平的方法，所述方法包括：
4、（1）将携带荧光基团和荧光淬灭基团的发夹dna修饰到纳米针芯片上，得到捕获探针；
5、（2）将纳米针芯片有针的一面朝向目标细胞放置，通过离心力使捕获探针刺入目标细胞，与其共同孵育；
6、（3）取出纳米针，分析纳米针芯片上的荧光信号，得到检测结果。
7、本专利技术所述方法简单高效，在单细胞尺度，高通量的获取活细胞内lncrna表达水平的平台。通过将设计的具有荧光自猝灭特性的发夹dna修饰到纳米针芯片上，同时利用纳米针对细胞无损的特性，在将纳米针通过离心机的向心力刺入细胞时，细胞中的目标lncrna与纳米针上的发夹dna互补配对，dna发夹颈环结构改变，探针的荧光开启，再将纳米针芯片取出，这样目标lncrna便可以被捕获，整个过程类似于钓鱼的方式。最后通过共聚焦显微镜对纳米针芯片上的lncrna分子表达谱的荧光图像进行分析和定量。获得多个lncrna靶点的表达水平，然后结合纳米针的亚细胞尺寸，进行单细胞水平分析。该方法为临床诊断和生物医学研究提供了一个全新的视角和检测平台。
8、其中包括发夹dna捕获探针的构建，具体来说是通过将荧光分子，以及荧光猝灭基团修饰到发夹dna捕获序列上，当目标分子不与捕获探针结合的时候，探针为发夹结构，荧光分子与猝灭基团近距离接触，荧光猝灭。但是当目标分子与探针结合的时候，发夹结构打开，荧光分子与猝灭基团距离变远，荧光得到释放。
9、优选地，所述发夹dna含有与目标lncrna碱基互补的核苷酸序列。
10、优选地，所述发夹dna中的荧光基团包括af488染料、af555染料或af 647染料中的任意一种，荧光猝灭基团包括bhq1或bhq2。
11、优选地，所述荧光猝灭基团修饰在发夹dna末端碱基，所述荧光基团修饰在发夹dna另一端与其互补配对的碱基。
12、优选地，所述离心的转速为300-400rpm/s，离心的时间为4-6 min。
13、所述转速可以选择300 rpm/s、310 rpm/s、320 rpm/s、330 rpm/s、340 rpm/s、350rpm/s、360 rpm/s、370 rpm/s、380 rpm/s、390 rpm/s、400 rpm/s等，所述时间可以选择4min、4.2 min、4.4 min、4.6 min、4.8 min、5 min、5.2 min、5.4 min、5.6 min、5.8 min、6min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14、优选地，所述孵育的时间为15-45 min。
15、所述时间可以选择15 min、18 min、20 min、22 min、25 min、28 min、30 min、32min、35 min、38 min、40 min、42 min、45 min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
16、优选地，步骤（3）分析操作还包括制备标准曲线。
17、优选地，标准曲线由包括如下步骤的制备方法制得：采用已知浓度的lncrna与捕获探针混合，分析混合杂交后纳米针芯片上的荧光信号，绘制浓度与荧光信号值的标准曲线。
18、优选地，所述纳米针的直径尺寸为200-700nm，例如200 nm、250 nm、300 nm、350nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
19、纳米针的直径尺寸在200-700nm之间，针与针之间的间距为5μm，远小于细胞的尺寸，使其可以实现单细胞级别的分析，从而实现对细胞内不同分子的异质本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发夹DNA含有与目标lncRNA碱基互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发夹DNA中的荧光基团包括AF488染料、AF555染料或AF647染料中的任意一种，荧光猝灭基团包括BHQ1或BHQ2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光猝灭基团修饰在发夹DNA末端碱基，所述荧光基团修饰在发夹DNA另一端与其互补配对的碱基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为300-400 rpm/s，离心的时间为4-6 min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为15-45 min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）分析操作还包括制备标准曲线。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，标准曲线由包括如下步骤的制备方法制得：采用已知浓度的lncRNA与捕获探针混合，分析混合杂交后纳米
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米针的直径尺寸为200-700nm。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法在lncRNA检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种实时检测活细胞内lncrna表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发夹dna含有与目标lncrna碱基互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发夹dna中的荧光基团包括af488染料、af555染料或af647染料中的任意一种，荧光猝灭基团包括bhq1或bhq2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光猝灭基团修饰在发夹dna末端碱基，所述荧光基团修饰在发夹dna另一端与其互补配对的碱基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为300-400 rpm/s，离心的时间为...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴仁军，杨德元，王子迅，李铖，孔玉彤，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。