平末端双链接头元件、试剂盒及平末端建库方法技术

本发明专利技术提供了一种平末端双链接头元件、试剂盒及平末端建库方法。该双链接头元件包括：A序列、B序列和C序列，其中，A序列从5

【技术实现步骤摘要】
平末端双链接头元件、试剂盒及平末端建库方法


[0001]本专利技术涉及测序文库构建领域，具体而言，涉及一种平末端双链接头元件、试剂盒及平末端建库方法。

技术介绍

[0002]在高通量测序过程中，DNA片段都需要构建成高通量测序文库才能够在高通量测序仪上进行测序。对普通的遗传突变DNA片段，其文库转化效率不必要求太高也能够实现准确检测，但是在低频的体细胞突变检测过程中，文库的转化效率是准确检测的关键影响因素。
[0003]目前在Illumina和MGI的测序平台都是通过TA连接的方式进行文库构建，建库接头是Y型或泡状接头，虽然Y型接头或泡状接头的所构建的文库都能够被测序仪测序，但是TA建库的文库转化效率受两个因素的影响，主要影响因素之一是加A的效率，由于末端加A的效率在4％～75％之间波动(J.M.Brownstein,J.D.Carptena andJ.R.Smith Modulation of Non
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Templated Nucleotide Addition by Taq DNAPolymerase:Primer Modifications that Facilitate Genotyping BioTechniques,199620:1004
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1010)，虽然建库试剂盒都在努力提升加A效率，但是也不能改变加A效率的天花板限制。另一个影响TA连接效率的因素是片段5
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端的磷酸化效率，尤其是当有5
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端碱基有损伤时，会影响磷酸化效率。Life technology的测序仪是通过平端连接的方式进行建库，这种建库接头是AB型，AB型的建库虽然平端连接避免了末端加A效率的限制，但是由于接头末端为避免接头自连而末端未进行磷酸化，连接后通过末端缺刻平移的方式实现双链的连接，由于这种方式有两种接头，有效接头占比只有50％AB接头文库，另一半是25％AA接头文库和25％BB接头文库是不能够被测序仪测序。
[0004]在解决如何实现平端连接绕开加A和5
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端磷酸化限制方面，现有技术也有报道利用腺苷化的接头和突变的T4DNA连接酶进行高效的平端连接，这种连接效率很高，但同时腺苷化的接头成本也极高。还有报道是利用分步连接和取代的方法实现接头的高效平端连接建库，该方案需要第二步接头连接采用退火竞争，操作步骤和流程过于繁琐。
[0005]因此，如何提供一种操作简便且成本低的平末端接头连接建库方案，便成为一个亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种平末端双链接头元件、试剂盒及平末端建库方法，以解决现有技术中TA接头连接效率低的问题。
[0007]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种平末端双链接头元件，该双链接头元件包括：A序列、B序列和C序列，其中，A序列从5
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端到3
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端依次包括A1段和A2段，C序列从5
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端到3
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端依次包括C1段、C2段和C3段，B序列与C1段互补配对，A序列通过A2段与C2段互补配对，A1段与C3段形成非配对区域，双链接头元件为A序列、B序列和C序列退火形
成的组合Y型接头，B序列的3
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端为ddN，C1段的5
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端具有磷酸化修饰。
[0008]进一步地，A1段和C3段的长度各自独立地为13
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25bp；优选地，A2段和C2段的长度均为8
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15 bp，更优选为13
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15bp；优选地，B序列和C1段的长度均为8
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15bp，更优选为12
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14bp；优选地，B序列包括分子标签序列，分子标签序列的长度为4
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8bp，更优选为6
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8bp。
[0009]进一步地，分子标签序列中含有RNA碱基，优选RNA碱基为U碱基。
[0010]进一步地，A序列和B序列共价连接形成一条链，并与C序列退火形成组合Y型接头。
[0011]进一步地，双链接头元件的序列选自如下任意一组：第1)组：A序列为SEQ ID NO:1：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG，B序列为：AGACAGN1ddN，C序列为SEQ IDNO:2：5
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P
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N2CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC，其中，N1表示5
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7个N碱基形成的序列，N2表示6
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8个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示磷酸化修饰；第2)组：A序列为SEQ ID NO:1，C序列为SEQ ID NO:3，B序列为：AGACAGN3UN4ddN，其中，N3表示2
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3个N碱基形成的序列，N4表示2
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3个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示磷酸化修饰；第3)组：双链接头元件用于illumina测序平台上，A序列和B序列共价连接于同一链，记为AB链，AB链的序列为：SEQ ID NO:3：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCUN5ddN，C序列为SEQ ID NO:4：5
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P
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N6AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；其中，N5表示3
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5个N碱基形成的序列，N6表示4
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6个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示磷酸化修饰；第4)组：双链接头元件用于MGI测序平台上，A序列和B序列共价连接于同一链，记为AB链，AB链的序列为：SEQ ID NO:5：TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTU N7ddN，C序列为SEQ ID NO:6：5
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P
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N8AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAC，其中，N7表示3
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5个N碱基形成的序列，N8表示4
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6个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示磷酸化修饰。
[0012]进一步地，A序列和B序列共价连接于同一链上，且C1段的5
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端磷酸化修饰被去除，B序列的3
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端ddN修饰被去除；优选地，双链接头元件选自如下任意一组：第5)组：双链接头元件用于MGI测序平台上，A序列和B序列共价连接于同一链，记为AB链，AB链的序列为：SEQ ID NO:7：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，C序列为SEQ IDNO:8：CTGTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种平末端双链接头元件，其特征在于，所述双链接头元件包括：A序列、B序列和C序列，其中，所述A序列从5
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端到3
’
端依次包括A1段和A2段，所述C序列从5
’
端到3
’
端依次包括C1段、C2段和C3段，所述B序列与所述C1段互补配对，所述A序列通过所述A2段与所述C2段互补配对，所述A1段与所述C3段形成非配对区域，所述双链接头元件为所述A序列、所述B序列和所述C序列退火形成的组合Y型接头，所述B序列的3
’
端为ddN，所述C1段的5
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端具有磷酸化修饰。2.根据权利要求1所述的双链接头元件，其特征在于，所述A1段和所述C3段的长度各自独立地为13
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25bp；优选地，所述A2段和所述C2段的长度均为8
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15bp，更优选为13
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15bp；优选地，所述B序列和所述C1段的长度均为8
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15bp，更优选为12
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14bp；优选地，所述B序列包括分子标签序列，所述分子标签序列的长度为4
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8bp，更优选为6
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8bp。3.根据权利要求2所述的双链接头元件，其特征在于，所述分子标签序列中含有RNA碱基，优选所述RNA碱基为U碱基。4.根据权利要求3所述的双链接头元件，其特征在于，所述A序列和所述B序列共价连接形成一条链，并与所述C序列退火形成所述组合Y型接头。5.根据权利要求1至4中任一项所述的双链接头元件，其特征在于，所述双链接头元件的序列选自如下任意一组：第1)组：所述A序列为SEQ ID NO:1：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG，所述B序列为：AGACAGN1ddN，所述C序列为SEQ ID NO:2：5
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P
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N2CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC，其中，N1表示5
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7个N碱基形成的序列，N2表示6
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8个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示所述磷酸化修饰；第2)组：所述A序列为所述SEQ ID NO:1，所述C序列为所述SEQ ID NO:3，所述B序列为：AGACAGN3UN4ddN，其中，N3表示2
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3个N碱基形成的序列，N4表示2
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3个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示所述磷酸化修饰；第3)组：所述双链接头元件用于illumina测序平台上，所述A序列和所述B序列共价连接于同一链，记为AB链，所述AB链的序列为：SEQ ID NO:3：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCUN5ddN，所述C序列为SEQ ID NO:4：5
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N6AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；其中，N5表示3
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5个N碱基形成的序列，N6表示4
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6个N碱基形成的序列，N选自A、C、T或G，ddN选自ddA、ddC、ddT或ddG，P表示所述磷酸化修饰；第4)组：所述双链接头元件用于MGI测序平...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡玉刚，汪彪，曲燕，吴强，
申请(专利权)人：纳昂达南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：