用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法技术

本发明专利技术涉及一种用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法，采用样本处理试剂，包括处理液、保护液、转化液、第一纯化液、第二纯化液、第三纯化液及收集液，处理液含0.1~0.5N氢氧化钠和4~8mol/L尿素，保护液含1~8mM异硫氰酸胍、0.1~5%SDS、5~150mMTris

【技术实现步骤摘要】
用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法


[0001]本专利技术涉及一种用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法，适用于生物医药体外检测


技术介绍

[0002]宫颈癌是发生在子宫颈部的女性常见的生殖系统恶性肿瘤，是危害女性健康和生命的重要疾病。在宫颈癌的防治中，早期诊断能够显著提高宫颈癌的检出率和患者生存率，目前，宫颈癌普遍采用液基细胞学、阴道镜和组织病理学诊断结合HPV检测进行早期筛查。但是采用以上方法诊断宫颈癌存在较多缺陷，如液基细胞学检查受主观因素影响较大，无法区分宫颈细胞病变级别，而且血液和黏液细胞的重叠会影响异常细胞辨识度，假阴率较高；组织病理学和阴道镜检查不仅取样困难，还会对患者宫颈造成伤害；HPV检测敏感性高、特异性较低，检测阳性结果仅表示存在短暂感染，预测宫颈癌发生与进展的价值还有待进一步确认。
[0003]随着生物技术的不断发展，鉴于已有宫颈癌检测方法的不足，以甲基化分析为代表的表观遗传学和表观基因组学在肿瘤检测中的作用逐渐受到人们的重视。PCR（Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应)、基因测序、循环游离DNA检测等方法对宫颈癌早期诊断具有较好的效果。然而，以上方法大多是基于核酸提取扩增后进行基因型检测，传统的核酸提取在裂解样本后还需要经过纯化、漂洗、干燥、洗脱等过程，随后才能进行转化、检测。整个处理过程步骤繁多，容易出错和污染，从样本提取到上机检测全程大约需要8h左右，耗时较长。
[0004]现有技术中也有较多节省处理时间的方法，如申请号为201910405182.3的公开专利所采用的方案，通过将样本裂解与磁珠吸附核酸同步进行，利用磁珠作为载体来吸附裂解后的DNA，起到初步提纯分离的作用，代替传统方法中的纯化、漂洗、干燥、洗脱等过程，进而达到缩短提取和转化时间的效果。然而，通过磁珠吸附代替纯化具有很大的局限性：首先，在磁珠等载体上进行提取转化的过程中会损失大量核酸DNA，不仅会影响后续PCR检测结果的可靠性，还会导致检测成本的增加；其次，将吸附有核酸DNA的磁珠直接置于高温（80~100℃）条件下进行转化，高温会对磁珠的吸附效果产生影响，从而影响到DNA的转化效果，导致后续PCR检测结果的准确性降低。
[0005]再如申请号为202210302663.3的专利公开了一种用于滤纸干血斑样本的核酸提取试剂及方法，该专利中通过碱裂解处理干血片样本，得到可用于PCR检测的待测样本。然而，由于宫颈脱落细胞样本与滤纸干血斑样本之间的差异，该专利所公开的方案在用于处理宫颈脱落细胞时，很容易对细胞样本造成破坏，导致无法提取到足够的核酸DNA，进而就会造成后续的PCR检测结果产生误差，导致出现误判。

技术实现思路

[0006]为了解决上述现有技术存在的缺陷，本专利技术提出了一种用于宫颈脱落细胞PCR检
测的样本处理方法。本专利技术采用的技术方案是：一种用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法，采用用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理试剂，处理试剂包括处理液、保护液、转化液、第一纯化液、第二纯化液、第三纯化液以及收集液，处理液包括0.1~0.5N氢氧化钠和4~8mol/L尿素，保护液包括1~8mM异硫氰酸胍、0.1~5% SDS、5~150mM Tris
‑
HCl、5~100mM EDTA，转化液包括100~500mM亚硫酸氢钠、50~250mM亚硫酸铵、2~15M亚硫酸氢铵、0.1~3M四氢糠醇、1~5mM TEPA、0.1~2M亚硫酸镁。
[0007]处理方法包括：S1、向样本中加入处理液，涡旋混匀后加入保护液，再次涡旋混匀后得到第一产物；S2、向第一产物中加入转化液，涡旋混匀后置于PCR仪中进行转化，得到第二产物；S3、向第二产物中加入混合有磁珠的第一纯化液，混匀后置于室温下静置1~6分钟，然后置于磁力架上磁分离1~10分钟，吸弃上清；S4、向步骤S3所得产物中加入第二纯化液进行漂洗，漂洗方法为涡旋振荡后置于磁力架上磁吸1~6分钟，然后吸弃上清；S5、向步骤S4所得产物中加入第三纯化液，涡旋振荡后置于室温下孵育，然后置于磁力架上磁吸1~6分钟，随后吸弃上清；S6、向步骤S5所得产物中加入第二纯化液，并按照步骤S4中漂洗方法进行漂洗，然后重复一次当前步骤，得到第三产物；S7、将第三产物中剩余液体全部吸弃并在室温下晾干，然后加入收集液，在室温下静置后置于磁力架上磁分离1~6分钟，吸取上清即得到所需待测样本。
[0008]进一步地，第一纯化液包括1~6mM异硫氰酸胍、0.1~0.4%乙二醇乙醚乙酸酯、0.6~1.5M盐酸胍、灭菌水，磁珠为羟基磁珠，且磁珠在第一纯化液中的含量为5~15mg/mL。
[0009]进一步地，第二纯化液包括70~90％乙醇、灭菌水。
[0010]进一步地，第三纯化液包括100~300mM氢氧化钠、50~150mM氯化钠、1~10%甘油、10~60%乙醇。
[0011]进一步地，收集液包括1~20mM Tris、0.05~0.15mM EDTA、灭菌水。
[0012]进一步地，步骤S1中，样本的体积与处理液的体积的比值为0.1~1，保护液的体积与处理液的体积的比值为0.1~2。
[0013]进一步地，步骤S2中，第一产物的体积与转化液的体积的比值为6.5~20。
[0014]进一步地，步骤S2中，在PCR仪中进行转化的转化条件为：先在95~101℃下反应2~12分钟，然后在54~62℃下反应30~80分钟，最后置于4℃下保存。
[0015]进一步地，第二产物的体积与第一纯化液的体积的比值为0.2~0.3，第二产物的体积与第二纯化液的体积的比值为0.25~0.375，第二产物的体积与第三纯化液的体积的比值为0.75~1.5。
[0016]进一步地，步骤S5中，在室温下孵育的时间为10~20分钟。
[0017]由于上述技术方案运用，本专利技术相较现有技术具有以下优点：本专利技术的用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法，通过处理液和保护液对宫颈脱落细胞进行裂解处理和保护处理后，可通过转化液直接进行转化等步骤，以得到PCR甲基化检测所需的检测样本，省去了传统处理方法中裂解后的纯化、漂洗、干燥、洗脱等过程，
不仅大大降低了整个处理过程的消耗时间，也简化了步骤，降低了处理过程中出错和污染的可能性。并且，在提取过程中无需通过磁珠等载体吸附DNA，不仅减少了提取过程中的DNA损失，节约了成本，保证了PCR检测结果的可靠性；也避免了进行转化时高温对载体产生不良影响，保证了转化效果，确保了PCR检测结果的准确性；进一步地，通过处理液及保护液对宫颈脱落细胞进行处理，还保证了样本的完整性，进一步提高后续PCR检测结果的准确性，避免出现误判。
附图说明
[0018]后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本专利技术的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的组件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：图1是本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法，其特征在于，采用用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理试剂，所述处理试剂包括处理液、保护液、转化液、第一纯化液、第二纯化液、第三纯化液以及收集液，所述处理液包括0.1~0.5N氢氧化钠和4~8mol/L尿素，所述保护液包括1~8mM异硫氰酸胍、0.1~5% SDS、5~150mM Tris
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HCl、5~100mM EDTA，所述转化液包括100~500mM亚硫酸氢钠、50~250mM亚硫酸铵、2~15M亚硫酸氢铵、0.1~3M四氢糠醇、1~5mM TEPA、0.1~2M亚硫酸镁；所述处理方法包括：S1、向所述样本中加入所述处理液，涡旋混匀后加入所述保护液，再次涡旋混匀后得到第一产物；S2、向所述第一产物中加入所述转化液，涡旋混匀后置于PCR仪中进行转化，得到第二产物；S3、向所述第二产物中加入混合有磁珠的所述第一纯化液，混匀后置于室温下静置1~6分钟，然后置于磁力架上磁分离1~10分钟，吸弃上清；S4、向步骤S3所得产物中加入所述第二纯化液进行漂洗，所述漂洗方法为涡旋振荡后置于磁力架上磁吸1~10分钟，然后吸弃上清；S5、向步骤S4所得产物中加入所述第三纯化液，涡旋振荡后置于室温下孵育，然后置于磁力架上磁吸1~10分钟，随后吸弃上清；S6、向步骤S5所得产物中加入所述第二纯化液，并按照步骤S4中所述漂洗方法进行漂洗，然后重复一次当前步骤，得到第三产物；S7、将所述第三产物中剩余液体全部吸弃并在室温下晾干，然后加入所述收集液，在室温下静置后置于磁力架上磁分离1~10分钟，吸取上清即得到所需待测样本。2.根据权利要求1所述的用于宫颈脱落细胞PCR检测的样本处理方法，其特征在于，所述第一纯化液包括1~6mM异硫氰酸胍、0.1~0.4%乙二醇乙醚乙酸酯、0.6~1.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景，杨笑笑，曾鳞，蔡思源，汪强虎，
申请(专利权)人：昂凯生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：