SMN基因主要转变区DNA扩增方法技术

本发明专利技术SMN基因主要转变区DNA扩增方法所属技术领域是医学遗传学。解决的技术问题：SMN基因主要转变区常规DNA及包含甲基化信息的DNA扩增方法。技术方案的要点：设计DNA扩增引物，引物3’端在相应的基因组内不包含核苷酸C，这样，PCR扩增可不受相应转变区末端是否潜在甲基化的影响。摸索出稳定优化的PCR反应条件。主要用途：筛查SMN基因主要转变区基因转变的分子背景的多态性位点，及DNA低甲基化与SMN基因转变潜在相关的CpG位点甲基化研究提供基础保证。对能使SMA病情相对减轻的机制研究提供前提条件，可应用于寻找基因治疗靶点。

【技术实现步骤摘要】
SMN基因主要转变区DNA扩增方法
医学遗传学
技术介绍
脊髓性肌萎缩(SMA)是最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉病，SMN1基因为SMA决定基因，可通过其基因缺失和基因内微小突变致病，SMN基因存在两个高度同源的拷贝，端粒拷贝(SMN1)和着丝粒拷贝(SMN2)，SMN2为修饰基因，在SMA个体中一些，国外发现有基因转变现象，为SMN1基因外显子8并列于SMN2基因外显子7，即为SMN1至SMN2基因转变。含转变的杂合基因可在一定程度上弥补SMN1基因缺失的影响，已证实基因转变可使SMN基因量增加，进一步使SMN转录物大为提高，使SMA病人症状相对较轻，但SMN基因主要转变区SMN基因内合子7-外显子8转变区基因结构复杂，国内外研究较少，还没有较好的该区基因扩增方法，我们总结摸索出简便，通用，经济的SMN基因主要转变区常规DNA及包含甲基化信息的DNA扩增方法。可对SMN基因转变的分子背景，及DNA低甲基化与SMN基因转变潜在相关的CpG位点进行甲基化研究提供基础保证。对能使SMA病情相对减轻的机制研究提供前提条件，可应用于寻找基因治疗靶点，指导进一步治疗研究。
技术实现思路
我们对SMN基因主要转变区SMN基因内合子7-外显子8转变区进行DNA扩增，SMN基因DNA进行亚硫酸氢钠处理后，在亚硫酸氢钠作用下可将基因组非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T，但甲基化的C则能抵抗亚硫酸氢钠的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异，对DNA进行亚硫酸氢钠处理后SMN基因主要转变区SMN基因内合子7-外显子8转变区再次进行DNA扩增，总结摸索出SMN基因主要转变区常规DNA及包含甲基化信息的DNA扩增方法。该方法简便，通用，经济。可对后续通过对SMN基因转变区DNA进行测序研究，筛查此区基因多态性(single-nucleotidepolymorphism，SNP)位点，作为重要的自发SMN基因转变的分子背景，及DNA低甲基化与SMN基因转变潜在相关的CpG位点进行甲基化研究提供基础保证。附图说明图1，图例代表SMN基因转变区的PCR扩增区相应位置图2，画虚线字母区代表相应的引物区，化横线的CG二核苷酸代表在相应SMN基因转变区的PCR扩增区内包含的4个CpG位点，SMN基因外显子8在之后。图3中电泳道为SMN基因主要转变区的PCR扩增产物495bp。图4电泳道为DNA经亚硫酸氢钠处理后SMN基因主要转变区的PCR扩增产物495bp具体实施方式我们对SMN基因主要转变区SMN基因内合子7-外显子8转变区进行DNA扩增，见图1，SMN基因DNA进行亚硫酸氢钠处理后，对SMN基因主要转变区SMN基因内合子7-外显子8转变区再次进行DNA扩增，总结摸索出SMN基因主要转变区DNA扩增方法。附：DNA的亚硫酸氢钠处理(基本原理是双链DNA变性解链后，在亚硫酸氢钠作用下可将基因组非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T，但甲基化的C则能抵抗亚硫酸氢钠的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异，且甲基化修饰只发生于5’-3’方向C-G相联结构的C上。)PCR扩增1、引物设计及合成应用PrimerPremier5.0软件，对SMN基因内合子7-外显子8转变区DNA及被亚硫酸氢钠处理的基因组SMN基因转变区内合子7-外显子8设计引物，引物3’端在相应的基因组内不包含核苷酸C，这样，PCR扩增可不受相应转变区末端是否潜在甲基化的影响。引物位置及cg位置见图2。引物由Invitrogen公司合成，各引物序列，扩增片段及退火温度详见表1。表1，引物条件及产物2、PCR反应体系经优化选择后，按以下条件进行PCR扩增反应总体积25μl，包括：PCR反应体系的配制均在冰上操作，最后加入TaqplusDNA聚合酶，混匀后分装。3、PCR优化反应条件扩增条件均为95℃预变性3min，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，循环35次，最后在72℃延伸5min。4、PCR扩增产物的检验PCR反应结束后，取PCR产物2μl，与6×Loadingbuffer预染液(按1/10000的比例加入genefinder染料)1μl混匀后加至2％的琼脂糖凝胶上样孔中，以6-8V/cm的电压电泳30分钟。凝胶在自动凝胶成像系统中扫描成像无杂带表明PCR扩增成功。普通DNA的SMN基因主要转变区的PCR扩增产物495bp扩增成功见图3，DNA经亚硫酸氢钠处理后SMN基因主要转变区的PCR扩增产物495bp扩增成功见图4。核苷酸序列表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SMN基因主要转变区常规DNA及包含甲基化信息的DNA扩增区域。NT_006713.Homo sapiens SMN2 19966999‑19967493；Homo sapiens SMN1 20842419‑20842914。

【技术特征摘要】
1.SMN基因主要转变区常规DNA及包含甲基化信息的DNA扩增区域。NT_006713.HomosapiensSMN219966999-19967493；HomosapiensSMN120842419-20842914。2.SMN基因主要转变区常规DNA及包含甲基化信息的DNA扩增引物序列。上游引物5’-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘维亮，李芳，陈炜，
申请(专利权)人：刘维亮，李芳，陈炜，
类型：发明
国别省市：贵州,52