DNA测序检测SMA简便方法及流程技术

本发明专利技术涉及检测SMA的简便方法及具体流程。技术方案的要点：DNA测序针对SMN内合子6‑外显子8的PCR产物，SMN1外显子7和8如为纯合缺失，仅有SMN2第7外显子上+6T和第8外显子上的+245A的纯合峰；可用于筛查相同SMN2拷贝数与SMA表型偏差的分子背景；SMN第7外显子上+6位和第8外显子上的+245位当出现套峰，如表型正常即正常人，如为患者可初略筛查SMN1的点突变。主要用途：可对98.6％的患者进行基因水平明确；可筛查出现相同SMN2拷贝数与SMA表型偏差的分子背景；剩余极少数杂合缺失并点突变SMA患者可筛查SMN1的点突变。非常适合基层医疗单位，且利于对本病机制的深入研究。

A Simple Method and Procedure for DNA Sequencing Detection of SMA

【技术实现步骤摘要】
DNA测序检测SMA简便方法及流程
医学遗传学
技术介绍
脊髓性肌萎缩(SMA)是最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉病，SMN1基因为SMA决定基因，可通过其基因缺失和基因内微小突变致病，SMN基因存在两个高度同源的拷贝，端粒拷贝(SMN1)和着丝粒拷贝(SMN2)，SMN2为修饰基因，目前认为SMN1基因第7外显子和/或第8外显子缺失突变是SMA发病的主要原因，约有95％的I-III型SMA患者有纯合SMN1第7外显子和/或第8外显子缺失。SMN1与SMN2基因仅有5个核苷酸不同，为第6内含子(-45G→A)，第7外显子(+6C→T)，第7内含子(+100A→G，+214A→G)，第8外显子(+245G→A)，在SMA个体中，既往国内外采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerasechainreactionrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)技术检测SMA的SMN1基因缺失。但该技术仅能粗略检测该病，不能详细反映该病基因异常的具体细节。现在国内外科研机构采用MLPA技术检测患者的SMN1基因拷贝数，鉴定纯合缺失SMN1基因患者，对筛选出杂合缺失SMN1基因患者，通过RT-PCR技术对其SMN基因(包括SMN1和SMN2)进行克隆，因SMN1与SMN2基因存在5个核苷酸序列的不同，PCR-RFLP可鉴定出含有SMN1基因的阳性克隆，通过进行DNA直接测序、基因组序列比较等分子生物学技术检测SMN1基因内的微小突变。该检测过程较繁琐，普通医疗单位很难掌握。我们针对SMN基因外显子7和8及其外显子和内含子交界处进行PCR扩增测序。检测SMN1基因纯合缺失，亦可用于筛查出现相同SMN2拷贝数与SMA表型偏差的分子背景，对筛选出杂合缺失SMN1基因患者，可通过对SMN1基因测序筛选SMN1基因内的微小突变。我们总结摸索出简便，通用，全面，经济的SMA患者检测方法及流程，因包含较多SMN基因信息，可较好的建立基因型和表型相关关系，非常适合基层医疗单位，且利于对本病机制的深入研究。
技术实现思路
我们对SMN基因DNA内合子6-外显子8进行PCR扩增，PCR扩增产物进行测序分析，因本病的SMN基因存在两个高度同源的拷贝，端粒拷贝(SMN1)和着丝粒拷贝(SMN2)，SMN1基因被定为SMA决定基因，SMN1基因外显子7和8如为纯合缺失，患者仅有SMN2基因第7外显子上+6T和第8外显子上的+245A的纯合峰，表明SMN基因仅有SMN2基因序列，而无SMN1基因序列，即为患者有纯合SMN1基因第7和第8外显子缺失，因约有98.6％的I-III型SMA患者有纯合SMN1第7外显子和/或第8外显子缺失，可对98.6％的该类患者进行明确，同时通过对SMN2基因测序分析还可发现其是否具有SMN2基因杂合单核苷酸多态位点(single-nucleotidepolymorphism，SNP)，可用于筛查出现相同SMN2拷贝数与SMA表型偏差的分子背景，SMN基因测序后SMN基因第7外显子上+6位和第8外显子上的+245位当出现套峰时，如果表型正常就是正常人，如有SMA表型则患者需进行SMN基因(包括SMN1和SMN2)克隆测序找到SMN1基因的点突变，如用DNA测序检测SMN基因可初略筛查SMN1基因的点突变情况。DNA测序检测SMA方法可对98.6％的该类患者进行基因水平明确，同时通过对纯合缺失SMN1基因患者的SMN2基因测序分析还可发现其是否具有SMN2基因SNP，剩余极少数杂合缺失并点突变SMA患者也可粗略筛查SMN1基因的点突变情况，故该方法相对简便，通用，全面，经济。附图说明图1纯合缺失SMN1基因患者SMN基因正向测序发现仅有SMN2基因第7外显子上+6T纯合峰图(图A)，SMN2第8外显子上的+245A纯合峰图(图B)(箭头示)；图2纯合缺失SMN1基因患者SMN2基因第7内含子存在杂合835-262C＞T基因多态位点图(箭头示)图3正常人SMN基因正向测序发现有第7外显子SMN1+6C与SMN2上+6T的套峰图(图A)，第8外显子上SMN1+245G与SMN2的+245A的套峰图(图B)(箭头示)图4杂合缺失SMN1基因合并杂合SMN1基因的点突变的患者SMN基因正向测序发现有第7外显子SMN2上+6T与SMN1+6C的套峰图(图A)，反向测序第8外显子上SMN2的+245A与SMN1+245G的套峰图(图B)，正向测序SMN1基因第5外显子c.683T＞A(p.Leu228X)杂合突变图(图C)(箭头示)具体实施方式我们对SMN基因DNA内合子6-外显子8进行PCR扩增，PCR扩增产物进行测序分析，总结摸索出DNA测序检测SMA简便方法及流程。一、PCR扩增1、引物序列及合成针对SMN基因内合子6-外显子8进行PCR扩增，由Invitrogen公司合成，各引物序列，扩增片段及退火温度详见表1。表1，引物条件及产物2、PCR反应体系反应总体积25μl，包括：加入高压处理的ddH2O至25.0μlPCR反应体系的配制均在冰上操作，最后加入TaqDNA聚合酶，混匀后分装。3、PCR反应条件PCR扩增条件为94℃预变性7min，94℃45sec，56℃45sec，72℃1min，循环30次，最后在72℃延伸10min。4、PCR扩增产物的检验PCR反应结束后，取PCR产物2μl，与6×Loadingbuffer预染液(按1/10000的比例加入genefinder染料)1μl混匀后加至2％的琼脂糖凝胶上样孔中，以6-8V/cm的电压电泳40分钟。凝胶在自动凝胶成像系统中扫描成像，如果电泳带型清晰，无杂带则表明PCR扩增成功。二、DNA测序检测SMA方法及流程DNA测序针对SMN基因内合子6-外显子8的PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序(美国ABI公司3730XL测序仪)。SMN1基因外显子7和8如为纯合缺失，患者仅有SMN2基因第7外显子上+6T和第8外显子上的+245A的纯合测序峰，表明SMN基因仅有SMN2基因序列，而无SMN1基因序列，即为患者有纯合SMN1基因第7和第8外显子缺失，检测成功见图1。因约有98.6％的I-III型SMA患者有纯合SMN1第7外显子和/或第8外显子缺失，可对98.6％的该类患者进行基因水平明确，同时通过对SMN2基因测序分析还可发现其是否具有SMN2基因杂合单核苷酸多态位点(single-nucleotidepolymorphism，SNP)，成功检出见图2，可用于筛查出现相同SMN2拷贝数与SMA表型偏差的分子背景。SMN基因测序后SMN基因第7外显子上+6位和第8外显子上的+245位当出现套峰时，如果表型正常就是正常人，见图3。如为患者(肌电图异常和/或有临床表现者)应用DNA测序检测SMN基因所有外显子可初略筛查SMN1基因的点突变情况(因SMN1基因为致病基因，杂合突变有致病意义，可推测致病位点在SMN1基因上)，可初步筛查出杂合缺失合并杂合SMN1基因点突变的患者，成功检测见图4。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DNA测序针对SMN基因内合子6‑外显子8的PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序，SMN1基因外显子7和8如为纯合缺失，患者仅有SMN2基因第7外显子上+6T和第8外显子上的+245A的纯合测序峰，表明SMN基因仅有SMN2基因序列，而无SMN1基因序列，即为患者有纯合SMN1基因第7和第8外显子缺失，可对98.6％的I‑III型SMA患者进行基因水平明确。

【技术特征摘要】
1.DNA测序针对SMN基因内合子6-外显子8的PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序，SMN1基因外显子7和8如为纯合缺失，患者仅有SMN2基因第7外显子上+6T和第8外显子上的+245A的纯合测序峰，表明SMN基因仅有SMN2基因序列，而无SMN1基因序列，即为患者有纯合SMN1基因第7和第8外显子缺失，可对98.6％的I-III型SMA患者进行基因水平明确。2.针对SMN1基因外显子7和8纯合缺失患者，DNA测序SMN2基因外显子1-8可发现其是否...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘维亮，何志旭，李芳，
申请(专利权)人：刘维亮，何志旭，李芳，
类型：发明
国别省市：贵州,52