基于焦磷酸测序的DNA测序装置及系统制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种基于焦磷酸测序的DNA测序系统，包括样品区、反应区、检测区和控制区；所述样品区包括可旋转的分离盘，所述分离盘包括至少一个DNA分离区，所述分离区包括内部设有滤膜的中空的过滤柱，连有亲和连接体的DNA单链和未连接亲和连接体的DNA单链经所述滤膜过滤后分离；所述反应区包括加样部和样品槽，所述加样部包括dNTP试剂槽、加样针架和安装于其上的多个加样针；所述加样针架位于样品槽上；所述样品槽上设有多个槽位；所述检测区包括生物发光检测装置，所述槽位与生物发光检测装置连接；所述样品区、反应区和检测区通过控制区监测、控制。本发明专利技术的基于焦磷酸测序的DNA测序装置及系统具有操作简便、快速检测的优点。

【技术实现步骤摘要】
基于焦磷酸测序的DNA测序装置及系统
本专利技术涉及一种基于焦磷酸测序的DNA测序装置，具体是涉及一种基于焦磷酸测序的基于焦磷酸测序的DNA测序装置及系统，属于基因检测领域。
技术介绍
一、焦磷酸测序概况焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是于1987年发展起来的、基于DNA合成过程中释放的焦磷酸(PPi)检测的测序技术，焦磷酸测序反应在一系列酶的催化作用下的，其过程中会产生与脱氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合数目成比例的可见光，通过对可见光检测可达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序有两种实现方法：液相焦磷酸测序法(LiquidPhasePyrosequencing)和固相焦磷酸测序法(SolidPhasePyrosequencing)。液相焦磷酸测序是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsμLfurylase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)协同作用下，将引物DNA上每一个dNTP的聚合与荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的(马永平等，焦磷酸测序技术及其在分子生物学领域的应用[J].国外医学分子生物学分册2003，25(2):115-117)。液相焦磷酸测序的反应体系由反应底物、待测单链、特异性测序引物和酶构成，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS)和荧光素(1uciferin)。液相焦磷酸测序反应过程是一个向反应体系中轮流加入4种dNTP参与反应的过程，每轮反应只有一种dNTP参加。如果加入的dNTP刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则其在DNA聚合酶的作用下被添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS结合形成ATP；在荧光素酶的作用下，生成的ATP又和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。如果加入的这种dNTP刚好能和DNA模板的下面连续n个相同碱基匹配，根据反应方程式可知，释放出的可见光强度应是只有1个碱基匹配时的n倍，也即反应过程中释放的光强度与相匹配的碱基数目成比例关系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一个碱基不匹配，则上述反应不会发生，也没有可见光的释放。未参加反应的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。每轮反应释放出的可见光通过微弱光检测装置转化，再被处理为数字信号，经PC软件处理即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低应和相匹配的碱基数目成比例关系。待上一轮反应结束后，加入另一种dNTP，重复进行上述反应。最终可根据获得的光强度峰值图即可读取的待测DNA序列信息。需要注意的是：dATP的降解产物脱氧单磷酸鸟苷(dAMP)是荧光素酶的抑制剂，随着反应的进行，其浓度会越来越高，会阻碍焦磷酸测序化学发光反应的继续进行。这也是焦磷酸测序法测序长度较短(通常为20bp～30bp)的主要原因(ShendureJ，eta1.Advancedsequencingtechnologies:Methodsandgoals，Nat.RevGenet.，2004，5(5):335-44)。固相焦磷酸测序是由3种酶催化的化学发光反应，与液相焦磷酸测序相比，没有三磷酸腺苷双磷酸酶参加。固相焦磷酸测序反应过程如下：结合了引物的DNA模板被固定于支撑物上并在反应过程中保持位置不变；加入一种dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和荧光素酶协同作用下发生反应，除了没有降解反应发生，其他反应与液相焦磷酸测序完全相同；在加入下一种dNTP前有一个冲洗步骤(washingstep)将上轮反应残留物完全冲走，不会有抑制性产物的堆积。通常情况下，人们所说的焦磷酸测序法指的是液相焦磷酸测序法，因为其四酶反应系统使得焦磷酸测序可以很方便地在单管中实现。Ronaghi等利用dATPαS替代dATP提高焦磷酸测序的信噪比(RonaghiM.eta1.Real-timeDNAsequencingusingdetectionofPPirelease；Anal.Biochem，1996，242(1):84-89)。因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效地利用，更有利于阅读富含T的区域。dATPαS是两种异构体Sp-dATPαS和Rp-dATPαS的混合物，聚合酶只能利用Sp-dATPαS。为了得到最佳反应效率，必须在反应体系中保持最佳浓度的Sp-dATPαS，与此同时Rp-dATPαS的浓度也在增加。dATPαS被Apyrase降解后仍会产生荧光素酶的抑制物，因此dATPαS的加入并没有提高读序能力。Gharizadeh等人对此进行了改进，他们在反应中只加入纯的Sp-dATPαS，而不加入无用的Rp-dATPαS，提高了反应的效率，大大降低了抑制产物的浓度，使得荧光素酶能够维持较长时间的活性，使焦磷酸测序法的测序长度增加到50bp～100bp，测序长度的增加也使得焦磷酸测序技术有了许多新的应用(GharizadehB.etal.，Long-readpyrosequencingusingpure2’-deoxyadenosine-5’-0’-(1-thiotriphosphate)Sp-isomer；AnalBinchem，2002.301:82-90)。在2000年举办的第十二届基因组测序和分析会议(12thInternationalGenomeSequencingandAnalysisConference)上，Ronaghi等人提出了一种移除抑制产物、减小稀释效应的方法，将测序长度增加到200bp。与sanger双脱氧链终止测序法相比，焦磷酸测序法具有快速、准确、经济、实时检测的特点；它不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有很高的可重复性；能实现高度的并行性和高度的自动化。二、焦磷酸测序技术的应用进展1在单核苷酸多态性研究中的应用单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)是近年来出现的第三代遗传标记，它指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少的一种在群体的频率不小于1％。SNPs是生物的基因组中最为常见的遗传多态型，它可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记；而正是这种基因组中的多态性，即基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性、对药物与环境因子不同反应的遗传学基础。SNP的研究主要包括两个方面：一是SNP数据库的构建，主要是发现特定种类生物基因组的全部或部分SNP。二是SNP功能研究，发现SNP只是SNP研究的第一步，SNP功能的研究才是SNP研究的目的。Sanger测序技术已成为大规模、准确、快速发现SNP的主流技术。而对数据库中已有SNP进行序列验证分析和频率分析，擅长短序列测序和验证的焦磷酸测序技术是很好的选择，采用焦磷酸测序技术进行SNP研究，更可以节约时间并降低消耗。Nordfors等分别采用Taqman荧光定量法和焦磷酸测序技术对高达1022个样本进行SNP基因分型研究，获得了相同的结果，此对照实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于焦磷酸测序的DNA测序装置，其特征在于，包括样品区、反应区和检测区；所述样品区包括可旋转的分离盘(2)，所述分离盘(2)位于反应区的上方，所述分离盘(2)包括至少一个DNA分离区，所述分离区包括内部设有滤膜(22)的中空的过滤柱(21)，连有亲和连接体的DNA单链和未连接亲和连接体的DNA单链经所述滤膜(22)过滤后分离；所述反应区包括加样部和样品槽(3)，所述加样部包括dNTP试剂槽(7)、加样针架(4)和安装于其上的多个加样针(41)，所述分离盘(2)位于试剂槽(7)的侧上方；所述加样针架(4)位于样品槽(3)上；所述样品槽(3)上设有多个槽位(31)；所述检测区包括生物发光检测装置(5)，所述槽位(31)与生物发光检测装置(5)连接；所述样品区、反应区和检测区安装在分析台(6)上，所述分析台(6)的侧面设有用于操作的机械手。

【技术特征摘要】
2017.01.12 CN 20171002220871.一种基于焦磷酸测序的DNA测序装置，其特征在于，包括样品区、反应区和检测区；所述样品区包括可旋转的分离盘(2)，所述分离盘(2)位于反应区的上方，所述分离盘(2)包括至少一个DNA分离区，所述分离区包括内部设有滤膜(22)的中空的过滤柱(21)，连有亲和连接体的DNA单链和未连接亲和连接体的DNA单链经所述滤膜(22)过滤后分离；所述反应区包括加样部和样品槽(3)，所述加样部包括dNTP试剂槽(7)、加样针架(4)和安装于其上的多个加样针(41)，所述分离盘(2)位于试剂槽(7)的侧上方；所述加样针架(4)位于样品槽(3)上；所述样品槽(3)上设有多个槽位(31)；所述检测区包括生物发光检测装置(5)，所述槽位(31)与生物发光检测装置(5)连接；所述样品区、反应区和检测区安装在分析台(6)上，所述分析台(6)的侧面设有用于操作的机械手。2.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序的DNA测序装置，其特征在于，所述分离盘(2)设有多个收集管(23)，所述过滤柱(21)安装于收集管(23)中，所述滤膜(22)位于过滤柱(21)一端的端部或过滤柱(21)的非端部。3.根据权利要求2所述的基于焦磷酸测序的DNA测序装置，其特征在于，所述收集管(23)设有可拆卸的上盖(231)，所述上盖(231)通过连接带(232)与收集管(23)连接。4.根据权利要求1所述的基于焦磷酸测序的DNA测序装置，其特征在于，所述试剂槽(7)设有多个反应位(74)...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，孙悦，
申请(专利权)人：武汉菲思特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42