Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法技术

本发明专利技术提供一种Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，所述方法包括将来源于同一个待测序列的所述高质量的碱基序列文件通过构建kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，使用kmer值进行所述高质量碱基序列拼接组装。本发明专利技术的Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法可以实现全分析流程自动化，只需设置好相关参数，中间无需人工参与，直接输出结果文件。

A Method for Determining Single Nucleotide Polymorphisms in Sanger Sequencing

【技术实现步骤摘要】
Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法。
技术介绍
Sanger测序是DNA测序技术的“金标准”，曾在人类基因组计划中发挥了关键推动作用，并且在现在仍被用来获得高度准确且可信赖的测序数据。在Sanger测序期间，DNA聚合酶通过向生长链(延伸产物)中加入核苷酸来复制单链DNA模板。链延长发生在引物的3′端，通过与模板的碱基对互补来选择加入到扩增产物中的脱氧核苷酸。Sanger测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。目前，Sanger测序数据的碱基质量需要根据abi文件中每个碱基对应的峰图值进行人工辨别以及手工去除低质量的碱基，具有一定的人为操作误差，同时现有的方法进行此步骤处理时，只能一条序列进行处理，结束以后输出结果再进行下一条序列的操作，严重影响了分析进度。而进行序列之间的拼接时，同样存在上述问题，一次只能进行一个样本的序列拼接，分析结果完成后才能进行下一个样本的分析。而针对一代Sanger测序数据进行SNP检测时，需要根据abi文件中同一位置的多个峰图值进行辨别，只有当次峰值与主峰值达到一定比值范围，才能判定此碱基位置存在SNP变异，由于目前方法中峰值无法进行数字量化，只能人工根据峰图高度进行估算，存在严重的人为操作误差，如果序列较长时，进行人工SNP判别需要花费大量时间，无法提高工作效率。而且基于一代Sanger测序数据的分析方法，无法在已有方法基础上进行改进以实现质控、拼接以及SNP检测的全自动化分析。
技术实现思路
在一种实施方式中，本专利技术提供一种Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据每个待测序列的长度，设计N对引物进行PCR扩增，N为不小于2的整数，N对引物能够完全覆盖待测序列；步骤2：对每个待测序列的扩增产物进行Sanger法测序，每个待测序列生成2N个Sanger测序abi文件，每个待测序列的abi文件进行命名，以便于根据该命名来识别来源于同一个待测序列；步骤3：将所述Sanger测序abi文件转化成文本格式文件，并对碱基信号值做归一化处理；步骤4：通过滑窗方法删除低于预设碱基质量值的序列，同步删除低于预设碱基质量值的序列区域所对应的碱基质量值，获得高质量碱基序列及相应的碱基质量值；步骤5：将来源于同一个待测序列的所述高质量的碱基序列文件通过构建kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，使用kmer值进行所述高质量碱基序列拼接组装；和步骤6：基于步骤4得到的高质量碱基序列及相应的碱基质量值，获得每个碱基位点的次最大碱基信号值和最大碱基信号值的比值，当该值大于预设值时，评估每条拼接组装后的序列的多态性位点，然后储存并输出每条待测序列的多态性位点信息。在一种实施方式中，所述滑窗方法中使用的滑窗范围为5-20bp，优选地为5-10bp。在一种实施方式中，所述预设碱基质量值为30-60，优选地为质量值范围为50-60。在一种实施方式中，在步骤2中，所述待测序列的每个abi文件以待测序列名称+引物名称方式进行命名。在一种实施方式中，将来源于同一个待测序列的高质量序列文件按照待测序列名称中的引物名称进行排序，分别构建相邻的两条待拼接序列的kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，分别从相邻两条序列所对应的哈希表的键中检索是否存在相同的代表kmer序列的键，并且该键仅对应唯一的值，当两条序列中不存在相同的键时，对kmer值减1，继续进行搜索，直至找到最大kmer值为止，基于相邻两条序列中同时存在且唯一的所有kmer序列所对应的位置信息，定位出两序列之间最大的重叠区间，获得该区间在两条序列中的位置信息。在一种实施方式中，所述kmer值范围为90-150bp。在一种实施方式中，所述预设值不小于0.25。在一种实施方式中，步骤6中，单核苷酸多态性位点识别结果以Excel文件格式输出，记录单核苷酸多态性位点在拼接序列中的坐标位置以及相对应的碱基。采用本专利技术的Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，可以在普通windows系统电脑上实现自动读取数据输入文件夹中的多个abi格式序列文件，根据文件名称将来源于同一样本的多条序列进行滑窗法自动过滤两端低质量碱基，完成序列拼接后进行SNP检测，输出SNP位点简并碱基，拼接序列及对应峰图结果到数据结果文件夹中，然后依次处理输入数据文件夹中的数据文件，直至完成所有数据文件。本专利技术的Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法可以实现全分析流程自动化，只需设置好相关参数，中间无需人工参与，直接输出结果文件。此方法可以避免在序列质控过滤以及SNP检测过程中人工判读产生的误差，得到的结果更精确。同时全自动流程可以大量节约分析时间，如果采用商业化方法进行序列质控和拼接，每次只能输入一个样本的序列进行分析，然后人工判读SNP位点信息后再输出相应的结果，一个样本大约需要3-5分钟的时间，而采用本专利技术方法只需5-6秒的时间即可完成同样的工作，极大的提升了工作效率。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是样本LSYZ2017020_SeqF3原始下机序列及滑窗长度(win)分别为5bp、10bp、15bp和20bp时进行低质量碱基去除后序列的5’和3’端峰图；图2是样本LSYZ2017020_SeqF3原始下机序列及固定滑窗长度(win)为5bp，碱基质量的平均值低于预设的碱基质量值(QC)30，40，50和60时被去除的序列的5’和3’端峰图；图3是样本LSYZ2017020的六条过滤后高质量序列文件，按照排序SeqR3-SeqR4-SeqRT-R2-SeqPRT-F2-SeqF3-SeqF4进行序列拼接组装，Kmer分别设置为20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，150，160，180和200的组装结果序列展示图；图4是样本LSYZ2017020的六条过滤后高质量序列文件拼接组装示意图及实际数据组装展示图；图5是样本LSYZ2017020的不同SNPcutoff值检测SNP位点峰图结果展示图；图6是样本LSYZ2017020的数据拼接及单核苷酸多态性位点识别结果展示图；图7是样本LSYZ2017032_SeqF3原始下机序列及滑窗长度(win)分别为5bp、10bp、15bp和20bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据每个待测序列的长度，设计N对引物进行PCR扩增，N为不小于2的整数，N对引物能够完全覆盖待测序列；步骤2：对每个待测序列的扩增产物进行Sanger法测序，每个待测序列生成2N个Sanger测序abi文件，每个待测序列的abi文件进行命名，以便于根据该命名来识别来源于同一个待测序列；步骤3：将所述Sanger测序abi文件转化成文本格式文件，并对碱基信号值做归一化处理；步骤4：通过滑窗方法删除低于预设碱基质量值的序列，同步删除低于预设碱基质量值的序列区域所对应的碱基质量值，获得高质量碱基序列及相应的碱基质量值；步骤5：将来源于同一个待测序列的所述高质量的碱基序列文件通过构建kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，使用kmer值进行所述高质量碱基序列拼接组装；和步骤6：基于步骤4得到的高质量碱基序列及相应的碱基质量值，获得每个碱基位点的次最大碱基信号值和最大碱基信号值的比值，当该值大于预设值时，评估每条拼接组装后的序列的多态性位点，然后储存并输出每条待测序列的多态性位点信息。...

【技术特征摘要】
1.Sanger法测序中确定单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：根据每个待测序列的长度，设计N对引物进行PCR扩增，N为不小于2的整数，N对引物能够完全覆盖待测序列；步骤2：对每个待测序列的扩增产物进行Sanger法测序，每个待测序列生成2N个Sanger测序abi文件，每个待测序列的abi文件进行命名，以便于根据该命名来识别来源于同一个待测序列；步骤3：将所述Sanger测序abi文件转化成文本格式文件，并对碱基信号值做归一化处理；步骤4：通过滑窗方法删除低于预设碱基质量值的序列，同步删除低于预设碱基质量值的序列区域所对应的碱基质量值，获得高质量碱基序列及相应的碱基质量值；步骤5：将来源于同一个待测序列的所述高质量的碱基序列文件通过构建kmer哈希表，以kmer序列为哈希表的键，以kmer序列在整条序列中出现的次数为该键所对应的值，使用kmer值进行所述高质量碱基序列拼接组装；和步骤6：基于步骤4得到的高质量碱基序列及相应的碱基质量值，获得每个碱基位点的次最大碱基信号值和最大碱基信号值的比值，当该值大于预设值时，评估每条拼接组装后的序列的多态性位点，然后储存并输出每条待测序列的多态性位点信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4中，所述滑窗方法中使用的滑窗范围为5-20bp，优选地为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志凯，张延明，杜楠，王柏婧，张萱，朱政英，王忠杰，许志华，万丽君，周鑫峰，
申请(专利权)人：北京诺赛基因组研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11