一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法技术

本发明专利技术提供一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法，所述方法包括完成样本数量≥22的SNP位点KASP方法分型检测，确定每个SNP位点不同基因型在KASP分型图中的范围；挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本和制成标准品；根据不同基因型标准品KASP分型图的范围，确定待测样品的基因分型。本发明专利技术补足了KASP技术一个位点一次性检测不得少于22个样本的空缺。

【技术实现步骤摘要】
一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法。
技术介绍
KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR)，即竞争性等位基因特异性PCR，基于引物末端碱基的特异匹配对指定的SNPs(singlenucleotidepolymorphisms，单核苷酸多态性)及InDels(InsertionsandDeletions，插入和缺失)进行双等位基因判定。因KASP技术对检测样本纯度及浓度(1-10ngDNA即可加入反应)要求不高，且具有高准确度、灵活性及低成本的特性。具体表现有支持低、中、高通量的样本研究，无需合成昂贵的特异性荧光标记引物或探针。KASP技术已被广泛应用于农业方向和医学方面，如动植物的品种改良，疾病筛查及预测、个体化用药及预后等。KASP技术适合小通量、中通量及大通量样本的检测，可灵活应用于98孔板、384孔板和1536孔板的检测。同时，KASP技术基于终点读板法进行基因型判读，即根据样本检测呈现的散点聚成的不同群簇进行不同的基因型判别。为了呈现较好的聚类分型效果及较准确的基因型分析结果，一个SNP分型一次检测样本应不少于22个。故KASP技术对较少位点的大量样本检测具有绝对的优势，但对于少量样本尤其是少于22个样本的检测却不是很友好。
技术实现思路
本专利技术采用近几年国际兴起的KASP分型技术，即竞争性等位基因特异性PCR，该方法同Taqman探针方法类似，同样采用双荧光标记，但KASP技术使用通用探针，位于反应混合液中，只需合成普通末端特异性碱基引物即可进行检测。KASP基于终端荧光信号的读取判断，每孔反应都是采用双色荧光检测一个SNP位点的两种基因型，不同的SNP对应着不同的荧光信号。KASP技术与TaqMan法类似，它与TaqMan技术不同的是，它不需要每个SNP位点都合成特异的荧光引物，它基于独特的ARMPCR原理，所有的位点检测终都可以使用通用荧光引物进行扩增，这降低了KASP技术的试剂成本，既有准确度，又降低了成本，更具SNP位点适用性。KASP技术具有准确、快速的特征外，同时具备灵活、经济的特点。为了解决上述问题，本专利技术提供一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：完成样本数量≥22的SNP位点KASP方法分型检测，确定每个SNP位点不同基因型在KASP分型图中的范围；步骤2：对步骤1中不同基因型的KASP分型结果进行Sanger测序验证，从中挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本；步骤3：挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本进行目的片段的分子克隆并制成标准品；和步骤4：在低于22个样本的KASP检测中，选用步骤3中得到的待测SNP位点不同基因型的标准品一同进行KASP检测，根据不同基因型标准品KASP分型图的范围，确定待测样品的基因分型。在一种实施方式中，所述方法在MTHFR基因rs1801133的SNP位点进行分型中的应用。在一种实施方式中，步骤1中KASP分型检测的引物包括用不同荧光标记二条正向KASP引物和一条通用反向KASP引物，二条正向KASP引物是SEQIDNO.1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTGCGTGATGATGAAATCGG；SEQIDNO.2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCGTGATGATGAAATCGA；和一条通用反向KASP引物是SEQIDNO.3：GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT。在一种实施方式中，二条正向KASP引物和一条通用反向KASP引物按照12:12:30的物质量比例加入反应体系。在一种实施方式中，二条正向KASP引物一条用FAM标记，另一条用HEX标记。在一种实施方式中，步骤3中不同基因型标准品是rs1801133的GG型样本的克隆质粒、AG型样本的克隆质粒和AA型样本的克隆质粒。KASP技术是基于终点法进行判读分析，实验要求每对引物样本不少于22个，否则会影响分群判读。本专利技术详述了如何构建一个位点的KASP检测方法，尤其详述了如何建立标准品以达到正确检测少于22个样本的KASP分型方法，补足了KASP技术一个位点一次性检测不得少于22个样本的空缺。同时，通过标准品的构建还可应用于不同时期扩增体系、扩增试剂的验证，及时指导实验室内部质控。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本专利技术的30个群体样本rs1801133位点KASP分型图；图2是本专利技术的第一组KASP引物30个样本KASP分型图；图3是本专利技术的第三组KASP引物30个样本KASP分型图；图4是本专利技术的挑选不同基因型代表样本示意图；图5是本专利技术的三种基因型阳性质粒测序结果图，其中图5A是GG型样本克隆质粒测序结果，图5B是AG型样本克隆质粒测序结果，和图5C是AA型样本克隆质粒测序结果；和图6是一个待检样本rs1801133位点KASP分型图。具体实施方式为了使本领域
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述。一、群体KASP检测1.30个受检者的基因组DNA获取采集受检者的口腔拭子，使用市面上可买到的相应提取试剂盒(如口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP322))，也可用自制的手提试剂进行基因组DNA提取。通过1％琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分别检测提取DNA的质量，结果显示提取的基因组DNA达到检测需求，即琼脂糖凝胶电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop检测A260/280介于1.7-2.0之间。稀释基因组DNA至10ng/μL备用，用于竞争性等位基因特异性PCR。2.竞争性等位基因特异性PCR根据NCBI上rs1801133位点的临近序列设计KASP引物，包括两条荧光标记识别的正向引物，和一条反向通用引物。引物序列如下：rs1801133-F1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTGCGTGATGATGAAATCGG(SEQIDNO.1)rs1801133-F2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCGTGATGATGAAATCGA(SEQIDNO.2)rs1801133-R1：GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT(SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法，所述方法包括以下步骤：/n步骤1：完成样本数量≥22的SNP位点KASP方法分型检测，确定每个SNP位点不同基因型在KASP分型图中的范围；/n步骤2：对步骤1中不同基因型的KASP分型结果进行Sanger测序验证，从中挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本；/n步骤3：挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本进行目的片段的分子克隆并制成标准品；和/n步骤4：在低于22个样本的KASP检测中，选用步骤3中得到的待测SNP位点不同基因型的标准品一同进行KASP检测，根据不同基因型标准品KASP分型图的范围，确定待测样品的基因分型。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于KASP技术对样本SNP位点进行分型的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：完成样本数量≥22的SNP位点KASP方法分型检测，确定每个SNP位点不同基因型在KASP分型图中的范围；
步骤2：对步骤1中不同基因型的KASP分型结果进行Sanger测序验证，从中挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本；
步骤3：挑出每个SNP位点不同基因型的代表样本进行目的片段的分子克隆并制成标准品；和
步骤4：在低于22个样本的KASP检测中，选用步骤3中得到的待测SNP位点不同基因型的标准品一同进行KASP检测，根据不同基因型标准品KASP分型图的范围，确定待测样品的基因分型。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在MTHFR基因rs1801133的SNP位点进行分型中的应用。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中KASP分型检测的引物包括用不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗慧芳，张延明，杜楠，何彤，冯秀丽，王丽娜，侯全民，
申请(专利权)人：北京诺赛基因组研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11