一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法，根据青胫控制基因位点设计引物，所述引物包括第一引物、第二引物、第三引物；所述第一引物的核苷酸序列为：SEQ ID No.1，所述第二引物的核苷酸序列为：SEQ ID No.2，所述第三引物的核苷酸序列为：SEQ ID No.3；然后建立PCR体系；之后设置空白对照，将所述PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替，作为所述空白对照；扩增所述PCR；最后扫描数据得到青胫控制基因的分型结果；本发明专利技术用于进行相关性状的研究和基因功能的探索。

【技术实现步骤摘要】
一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法
本专利技术涉及分子标记育种领域，具体涉及一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法。
技术介绍
鸡的胫色具有多样性，家禽的胫色主要包括白色、黄色、青色和豆绿色等颜色。与皮肤性状一样，鸡的胫色性状也是重要的质量性状，丰富多样的胫色表型由基因调控黑色素和类胡萝卜素在胫部的沉积而决定的。早期的研究发现控制胫色的关键基因是真皮黑色素抑制基因，该基因的遗传方式为不完全显性的伴性遗传。当该基因不表达时，家禽个体表现出青胫性状。Smyth等发现24号染色体上的W基因座和Z染色体上的Id基因座是影响胫色的主要遗传因素，W和Id相互作用会造成胫色的多样性。Siwek等报道与前人的结论一致，通过24号染色体和Z染色体上的单核苷酸多态性GGA24和GGAZ关联性分析表明，浅绿色的胫色表型与隐性等位基因位点W和Id有着显著的关系。胫色性状相关基因位点有W位点和Id基因，W位点已经被确定为24号染色体上的BCDO2基因，但是Id基因的具体位置还是扑朔迷离。关于Id基因的定位工作开始已久，最早在1988年，Bitgood等发现Z染色体上的B，Id，TB，y位点之间存在连锁关系，四个位点呈现出B-Id-TB-y的线性关系。研究者在2004年使用物理图谱定位的方法，发现Id位点在Z染色体上与ACO1相距约20cM的长臂末端处。2009年，国外研究者Dorshorst利用F2代基因分离群体，应用全基因组关联分析的方法，发现Id基因位于Z染色体上67.1-72.3Mb之间的物理区间内。在2010年，Dorshorst等人通过进一步研究精确了Id的位置，发现Z染色体72.31Mb位置处的一个与青胫性状显著相关的SNP(rs14686603)，同时预测Id的候选基因可能是B4GALT1。随后，研究报道了Id基因与Z染色体的71,945,632-73,291,823bp区域紧密连锁。在2014年，研究者建立了固始鸡-安卡鸡F2代资源群体，采集极端胫色表型的个体的血液样本构建DNA混池，使用目标序列捕获测序的方法将Id基因定位更加精细，定位于Z染色体71.58-72.18Mb之间0.4Mb的区段内。后续的研究者通过高通量测序和GWAS的方法将Id基因定位区间缩小，并发现了大量的候选基因。但是，Id基因的具体位置仍是学术界需要解决的一个重要难题，这关乎相关性状的研究和基因功能的探索任务的顺利进行。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种本专利技术是通过以下技术方案予以实现：一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法，具体步骤如下：S1：根据青胫控制基因位点设计引物，所述引物包括第一引物、第二引物、第三引物；所述第一引物的核苷酸序列为：SEQIDNo.1，所述第二引物的核苷酸序列为：SEQIDNo.2，所述第三引物的核苷酸序列为：SEQIDNo.3；S2：建立PCR体系；S3：设置空白对照，将所述PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替，作为所述空白对照；S4：扩增所述PCR；S5：扫描数据得到青胫控制基因的分型结果。进一步地，所述S4步骤中，94℃预变性15min，94℃变性20s，55-61℃退火和延伸60s，进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；进一步地，所述S2步骤中，建立的所述PCR体系中的DNA为鸡血液DNA,所述鸡血液DNA获取方法如下：S21：向离心管中加入ProteinaseK，之后加入鸡的血液；S22:向所述离心管中加入BufferML，涡旋振荡5秒钟，将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；S23：从所述水浴锅中取出所述离心管，离心后室温放置5分钟，加入混匀的异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将所述离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将所述离心管连续颠倒混匀10分钟；S24：将所述离心管放于磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads吸附于所述离心管侧壁后弃去溶液；S25：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入无水乙醇，加入BufferGW1，涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads吸附于所述离心管侧壁后颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液；S26：重复所述步骤S25；S27：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入无水乙醇，加入BufferGW2，后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，将所述离心管放于所述磁力架静置1分钟，待所述Magbeads吸附于所述离心管侧壁后颠倒所述磁力架，清洗所述离心管盖上的杂质，弃去溶液；S28：重复所述步骤S27；S29：保持所述离心管固定于所述磁力架上，用移液器移除所述离心管的管底和管盖上的溶液，室温放置5-10分钟，使乙醇充分挥发；S210：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入BufferEB，涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；S211：将所述离心管放于所述磁力架上静置2分钟，待所述Magbeads充分吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。进一步地，所述步骤S29中，如所述离心管侧壁上有液珠，向所述离心管中加入无水乙醇，保持所述离心管固定于所述磁力架上，盖盖后颠倒所述离心管，弃去全部无水乙醇。进一步地，所述PCR体系包括所述鸡血液DNA、KASPMasterMix以及所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物的混合物。本专利技术的有益效果是：本专利技术的技术是一种对鸡青胫基因的分子鉴定方法，通过对青胫基因和黄(白)胫基因的核苷酸序列比对后设计引物，FAM标记的引物1与青胫基因特异匹配，HEX标记的引物2与黄(白)胫基因特异匹配，通用引物为反向引物，反向引物结合后，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。FAM标记的引物1与青胫基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为青胫基因纯合子，记为tt；HEX标记的引物2与黄(白)胫基因特异匹配后扩增，仅检测到HEX荧光即为黄(白)胫基因纯合子(表型为青黄(白)胫)，记为TT；如果同时检测到FAM和HEX信号，则为青胫杂合子，记为Tt。。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法，其特征在于，具体步骤如下：/nS1：根据青胫控制基因位点设计引物，所述引物包括第一引物、第二引物、第三引物；所述第一引物的核苷酸序列为：SEQ ID No.1，所述第二引物的核苷酸序列为：SEQ ID No.2，所述第三引物的核苷酸序列为：SEQ ID No.3；/nS2：建立PCR体系；/nS3：设置空白对照，将所述PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替，作为所述空白对照；/nS4：扩增所述PCR；/nS5：扫描数据得到青胫控制基因的分型结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：根据青胫控制基因位点设计引物，所述引物包括第一引物、第二引物、第三引物；所述第一引物的核苷酸序列为：SEQIDNo.1，所述第二引物的核苷酸序列为：SEQIDNo.2，所述第三引物的核苷酸序列为：SEQIDNo.3；
S2：建立PCR体系；
S3：设置空白对照，将所述PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替，作为所述空白对照；
S4：扩增所述PCR；
S5：扫描数据得到青胫控制基因的分型结果。


2.根据权利要求1所述的一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法，其特征在于，所述S4步骤中，
94℃预变性15min，94℃变性20s，55-61℃退火和延伸60s，进行10个循环；
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。


3.根据权利要求1所述的一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法，其特征在于，所述S2步骤中，建立的所述PCR体系中的DNA为鸡血液DNA,所述鸡血液DNA获取方法如下：
S21：向离心管中加入ProteinaseK，之后加入鸡的血液；
S22:向所述离心管中加入BufferML，涡旋振荡5秒钟，将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S23：从所述水浴锅中取出所述离心管，离心后室温放置5分钟，加入混匀的异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将所述离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将所述离心管连续颠倒混匀10分钟；
S24：将所述离心管放于磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads吸附于所述离心管侧壁后弃去溶液；
S25：将所述离心管从所述磁力架上取下，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继强，
申请(专利权)人：北京康普森农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11