用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统技术方案

本公开涉及一种用于CCDC6‑RET融合基因检测的试剂组合物，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。利用本公开提供的试剂组合物，能够对待测样本中的CCDC6‑RET融合基因进行高灵敏度的检测，检测时间较短，所需设备简单，反应条件温和，在常温下即可实现对CCDC6‑RET融合基因的量化检测和可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及检测系统
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物、试剂盒及系统。
技术介绍
RET基因位于人10号染色体的长臂上，全长约60kb，含有21个原癌基因外显子。RET基因能够编码酪氨酸激酶受体RET蛋白，RET蛋白可与配体结合并刺激胞内产生磷酸化，参与调节机体细胞的生长和分化。RET基因易在其酪氨酸激酶域编码区发生断裂，断裂后的3’端和其伙伴基因的5’端发生融合，形成融合突变，会导致原癌基因的转化和激酶的活化，诱发恶性肿瘤。约2％的肺腺癌、20％的甲状腺乳头状癌等实体型肿瘤中存在RET基因的融合突变。RET基因的融合突变在肺腺癌中的融合类型主要为KIF5B-RET和CCDC6-RET。针对RET基因融合突变的靶向药物对肿瘤具有良好的治疗效果。检测融合突变后的RET融合基因，对临床治疗及指导合理用药具有较大的临床价值。目前，CCDC6-RET融合基因的检测方法主要包括FISH、IHC、RT-PCR及PCR/Sanger测序。然而，上述检测方法对CCDC6-RET融合基因的检测灵敏度较低，检测时间较长，且部分方法对检测条件要求较高。
技术实现思路
为了解决现有CCDC6-RET融合基因检测方法中存在的灵敏度低、所需时间长、检测条件要求高的问题，本公开提供一种试剂组合物、试剂盒及系统。为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。可选地，所述试剂组合物还包括引物对，所述引物对包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。可选地，所述CCDC6-RET融合基因为存在CCDC6exon1-RETexon12融合基因。可选地，所述单链DNA荧光探针包括如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种。第二方面，本公开提供一种用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面中任意一项所述的试剂组合物。可选地，所述试剂盒中还含有反应体系缓冲液、RNase抑制剂、Mg2+和水。可选地，所述试剂盒中含有以下含量的各组分：20μL试剂中含有0.3～0.4μM的引物对、300～500nM的crRNA，14～15μL的Rehydrationbuffer、150～200nM的单链DNA荧光探针、5～10U的RNase抑制剂、2～3μL的NEBuffer2.1、0.3～0.6μL的醋酸镁、200～300nM的Cas12a酶。第三方面，本公开提供第一方面中任意一项所述的试剂组合物在制备用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂盒中的用途。第四方面，本公开提供一种用于CCDC6-RET融合基因检测的系统，该系统包括第一反应管、第二反应管、检测器和计算装置；其中，所述第一反应管中设有RPA试剂，用于对待测样本的cDNA进行RPA扩增，得到扩增产物，其中，所述RPA试剂中含有RPA引物，所述RPA引物包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；所述第二反应管中设有Cas12a酶、单链DNA荧光探针和crRNA，用于在存在所述扩增产物时，进行Cas12a酶切反应，得到酶切产物，其中，crRNA包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，酶切反应时间为5-15分钟；所述检测器设有紫外发光装置和荧光检测装置，所述紫外发光装置用于对所述酶切产物进行紫外光照射，所述荧光检测装置用于检测所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：当所述荧光检测装置检测到所述酶切产物在紫外光照射下的荧光值为500～3000时，判定所述待测样本中存在CCDC6-RET融合基因。可选地，所述CCDC6-RET融合基因为CCDC6exon1-RETexon12融合基因。通过上述技术方案，利用本公开提供的试剂组合物，能够对待测样本中的CCDC6-RET融合基因进行高灵敏度的检测，检测时间较短，所需设备简单，反应条件温和，在常温下即可实现对CCDC6-RET融合基因的量化检测和可视化检测。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的第一方面提供一种用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。利用上述试剂组合物，当crRNA与CCDC6-RET融合基因特异性结合时，Cas12a酶的检测活性被激活，激活状态下的Cas12a酶能够剪切单链DNA荧光探针，并释放荧光探针中的荧光基团，因此，可以根据是否检测到荧光基团来判断检测系统中是否存在CCDC6-RET融合基因。利用上述试剂组合物能够对待测样本中的CCDC6-RET融合基因进行高灵敏度的检测，检测时间较短，所需设备简单，反应条件温和，在常温下即可实现对CCDC6-RET融合基因的量化检测和可视化检测。根据本公开，所述试剂组合物还可以包括用于对CCDC6-RET融合基因区域进行RPA扩增的引物对，所述引物对可以包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。利用上述引物对，可以对待测样本中的CCDC6-RET融合基因区域进行扩增，提高CCDC6-RET融合基因在检测系统中的丰度，使crRNA能够更容易地匹配到CCDC6-RET融合基因，从而提升检测灵敏度，实现在复杂样本/杂合体突变样本中进行高灵敏度的检测。可选地，所述CCDC6-RET融合基因为CCDC6exon1-RETexon12融合基因。所述CCDC6-RET融合基因一般存在于肿瘤细胞中，例如肺癌细胞、甲状腺癌细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、食管癌细胞和黑色素瘤细胞。根据本公开，所述单链DNA荧光探针可以在较宽的范围内选择，不与检测系统中其它成分杂交或反应的单链DNA荧光探针均可用于本公开。示例性地，所述单链DNA荧光探针可以包括如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种。本公开的第二方面提供一种用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面中任意一项所述的试剂组合物。可选地，所述试剂盒中还含有反应体系缓冲液、RNase抑制剂、Mg2+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括crRNA、Cas12a酶和单链DNA荧光探针，其中，所述crRNA包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物还包括引物对，所述引物对包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述CCDC6-RET融合基因为CCDC6exon1-RETexon12融合基因。


4.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述单链DNA荧光探针包括如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列以及荧光基团，所述荧光基团包括FAM荧光基团、HEX荧光基团和TAMRA荧光基团中的至少一种。


5.一种用于CCDC6-RET融合基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1～4中任意一项所述的试剂组合物。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有反应体系缓冲液、RNase抑制剂、Mg2+和水。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有以下含量的各组分：
20μL试剂中含有0.3～0.4μM的引物对、300～500nM的crRNA，14～15μL的Rehydrationbuffer、150～200nM的单链DNA荧光探针、5～10U的RNase抑制剂、2～3μL的NEBuffer2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李程，肖金平，孙志坚，康平，
申请(专利权)人：浙江科途医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33