一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法技术

本公开涉及一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12‑96h，得到第一培养物，检测第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；b、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12‑96h，得到第二培养物，检测第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；c、将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2‑8h，得到第三培养物，检测第三培养物中的细胞因子水平并计算溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，细胞因子包括白细胞介素‑2和/或γ‑干扰素；如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示待测溶瘤病毒的有效性高于参比溶瘤病毒。本公开的检测方法能较真实地检测溶瘤病毒的有效性。

A method for detecting the effectiveness of oncolytic virus by organ like method

【技术实现步骤摘要】
一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法
本公开涉及生物医药
，具体涉及一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法。
技术介绍
溶瘤病毒是通过对天然存在的致病力较弱的病毒进行基因改造而形成的特殊病毒。溶瘤病毒能利用肿瘤细胞中畸变的信号通路(如抑癌基因的失活或缺陷)而选择性地感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内大量繁殖从而摧毁肿瘤细胞，但是其无法感染正常细胞。同时，溶瘤病毒还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。溶瘤病毒作为肿瘤治疗的生物药，需要筛选其对肿瘤患者治疗的有效性和安全性。相关技术中，利用肿瘤细胞进行2D培养得到的单层细胞系或者PDX模型进行溶瘤病毒有效性的检测。然而，利用上述检测方法检测得到的溶瘤病毒有效性数据与临床研究阶段得到的溶瘤病毒有效性数据存在较大差异。作为生物药的溶瘤病毒，其药物有效性和安全性与肿瘤微环境及患者自身免疫系统对药物的反应关系密切，因此急需更能真实模拟患者体内肿瘤的模型和检测方法，对溶瘤病毒的有效性进行评判，从而筛选出具有更大临床转化价值的溶瘤病毒药物。
技术实现思路
本公开提供了一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法中使用的类器官能够更真实模拟患者体内肿瘤异质性及药物反应情况，本检测方法建立了一种快速从溶瘤病毒复制能力、溶瘤能力及诱导宿主抗肿瘤免疫作用等三个方面评价溶瘤病毒对不同患者肿瘤溶瘤有效性的方法，可用于临床前期药物有效性测试及临床入组病人的筛选。为了实现上述目的，本公开提供一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；c、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。可选地，步骤a中还包括将肿瘤类器官进行第一预培养的步骤，然后再将第一预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第一预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于5000-10000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为500-1000μL，肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；步骤b中还包括将肿瘤类器官进行第二预培养的步骤，然后再将第二预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第二预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于300-1000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为30-80μL，肿瘤类器官培养液的用量为100-150μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；步骤c中，所述将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养，包括：c1、将含有免疫细胞和肿瘤类器官的细胞悬液接种在培养皿中，加入肿瘤类器官培养液培养2-8h，得到混合培养液，其中所述细胞悬液中免疫细胞和肿瘤细胞的浓度为0.1-1×107个/mL，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝(2-8)：1，相对于0.5-2mL所述细胞悬液，所述肿瘤类器官培养液的用量为2-3mL；c2、将所述混合培养液与溶瘤病毒混合培养3-5h，所述溶瘤病毒的用量为1-100MOI。可选地，步骤a中，所述检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平，包括：a1、获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒；a2、将所述待测病毒与所述溶瘤病毒的宿主细胞混合培养12-96h，然后检测所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度；其中，所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度越高，所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平越高。可选地，步骤a1中，所述获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒，包括：将所述第一培养物进行冻融处理2-8次，然后进行离心并收集上清液，得到待测病毒液，所述待测病毒液中含有所述待测病毒。可选地，步骤b中，利用CCK8试剂盒检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；步骤c中，利用ELISA试剂盒检测所述第三培养物中的细胞因子水平。可选地，步骤c中所述免疫细胞从患者外周血中分离得到。可选地，步骤a、步骤b和步骤c中所述的混合培养在肿瘤类器官培养液中进行，所述肿瘤类器官培养液包括DMEM/F12培养基和生长因子；所述生长因子包括Glutamax、HEPES、Gastrin、nicotinamide、A83-01、Noggin、n-Acetylcysteine、青链霉素、EGF和BSA中的至少一种。可选地，所述生长因子中，所述Glutamax的浓度为0.5-2％、所述HEPES的浓度为5-15mM、所述Gastrin的浓度为5-15nM、所述nicotinamide的浓度为5-15mM、所述A83-01的浓度为250-600ng/mL、所述Noggin的浓度为50-150ng/mL、所述n-Acetylcysteine的浓度为0.5-2mM、所述青链霉素的浓度为50-150μg/mL、所述EGF的浓度为50-150ng/mL、所述BSA的浓度为0.001-0.005mg/mL。可选地，所述肿瘤类器官的制备方法包括：将肿瘤细胞、温敏性水凝胶和肿瘤类器官培养液混合并进行培养，每隔2-4天更换一次培养基，直至显微镜下观察到直径不小于0.5mm的肿瘤类器官。可选地，相对于20000个所述肿瘤细胞，所述温敏性水凝胶的用量为1500-2000μL，所述肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL。通过上述技术方案，本公开的方法采用肿瘤类器官作为溶瘤病毒有效性检测的肿瘤细胞模型，由于肿瘤类器官能够较好地反映患者体内肿瘤组织的生物学特性，因此，本公开方法的检测结果能较真实地反映溶瘤病毒在患者体内对肿瘤组织溶瘤作用的有效性。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开提供一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；c、将所述溶瘤病毒、免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，其特征在于，该方法包括：/na、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；/nb、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；/nc、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；/n如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，其特征在于，该方法包括：
a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；
b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；
c、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；
如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中还包括将肿瘤类器官进行第一预培养的步骤，然后再将第一预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第一预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于5000-10000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为500-1000μL，肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；
步骤b中还包括将肿瘤类器官进行第二预培养的步骤，然后再将第二预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第二预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于300-1000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为30-80μL，肿瘤类器官培养液的用量为100-150μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；
步骤c中，所述将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养，包括：c1、将含有免疫细胞和肿瘤类器官的细胞悬液接种在培养皿中，加入肿瘤类器官培养液培养2-8h，得到混合培养液，其中所述细胞悬液中免疫细胞和肿瘤细胞的浓度为0.1-1×107个/mL，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝(2-8)：1，相对于0.5-2mL所述细胞悬液，所述肿瘤类器官培养液的用量为2-3mL；c2、将所述混合培养液与溶瘤病毒混合培养3-5h，所述溶瘤病毒的用量为1-100MOI。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平，包括：
a1、获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙志坚，康平，李程，
申请(专利权)人：浙江科途医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33