一种N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法技术

本发明专利技术属糖蛋白质组学和糖组学分析领域，涉及一种N‑糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法，其包括：使用脱脂棉材料吸取含糖蛋白样品的溶液，并在棉上进行高温快速PNGase F酶解释放N‑糖链；在酶解结束后调节溶液环境，利用脱脂棉材料表面高密度的羟基与糖链的氢键等作用，将游离糖链吸附在脱脂棉材料上，随后将未和脱脂棉材料结合的非糖链分子，如蛋白质、多肽等清洗除去，最后使用水溶液将吸附的糖链洗脱，送入质谱分析。本发明专利技术方法使用材料廉价易得，易于制备，操作简便，可以实现N‑糖蛋白的高速酶解及N‑糖链的高选择性富集、高灵敏度质谱分析。

A method for rapid enzymatic interpretation, solid-phase enrichment and mass spectrometry of N-sugar chain

【技术实现步骤摘要】
一种N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法
本专利技术属糖蛋白质组学和糖组学分析领域，涉及糖蛋白质中N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法。本专利技术方法较目前常用的N-糖链富集和质谱分析方法具有更高选择性和更高的分析灵敏度，且能显著地缩短从血清等样品中获取糖链所需的时间，具有步骤简单、操作方便及快速等特点。
技术介绍
现有技术公开了蛋白质N-糖基化是生物体内最为普遍存在的翻译后修饰之一，据研究报道，哺乳动物中50％以上的蛋白质可发生N-糖基化修饰。研究表明，糖基化具有重要的生物学意义，与蛋白连接的N-糖链在细胞识别和分子识别，蛋白质折叠，维持蛋白质正确构象中起到重要作用；N-糖链分布、组成与结构的改变进而影响这些生物进程。研究显示，在癌症、心血管疾病、自身免疫病等多种疾病中，N-糖基化的异常扮演着重要角色。因此，对生物体内的N-糖链进行高选择性、高灵敏度的分析将有利于生理学与病理学研究，也可提供潜在的生物标志物。然而，N-糖链研究面临着如下困难：首先，尽管N-糖基化的蛋白种类丰富，但糖基化修饰比例相对较低，换言之，N-糖链的总体丰度处于较低水平；其次，N-糖链存在微观不均一性，即同一糖基化位点上可能存在不同组成的N-糖链，使得单个N-糖链的丰度也处于较低水平，对分析方法的灵敏度有更高要求；再次，在质谱分析过程中，N-糖链缺少疏水基团和带有稳定电荷的基团，离子化效率低，信号也更易被样品中易于离子化的肽段、蛋白等物质抑制；最后，尽管目前已有一些用于N-糖链富集的微柱、微枪头等工具，但其往往存在选择性低，价格昂贵，操作时间长的问题。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种基于更为廉价易得材料的N-糖链快速酶解，固相富集与质谱分析方法，该方法将有利于实现复杂生物样品中N-糖链的快速前处理，高选择性富集和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质组学和糖组学的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的N-糖链质谱分析前样本处理方法存在的缺陷，提供一种成本低廉，步骤简单、操作方便、快速高效的实现N-糖蛋白样品中N-糖链快速酶解，选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的新方法，具体涉及一种N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法。具体的，本专利技术提供了一种基于脱脂棉材料基质，对N-糖链进行快速酶解释放，并原位富集N-糖链并质谱分析的方法；本专利技术利用脱脂棉的强吸附性，将其用于血清等样品的吸附；脱脂棉结构疏松多孔，有利于棉上高速酶解的进行；材料表面高密度的羟基有利于在原位对糖链进行基于亲水性相互作用的富集，肽段、蛋白及盐类等物质可通过乙腈-水溶液从材料上清洗除去，被材料捕获的糖链可使用水溶液洗脱以便后续质谱分析，从而实现N-糖蛋白样品的高效前处理。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.使用脱脂棉材料吸取含糖蛋白样品的溶液，并在棉上进行高温快速PNGaseF酶解释放N-糖链；2.使用脱脂棉材料，使用离心辅助方法富集溶液中游离的N-糖链，通过适当清洗除去肽段、蛋白等杂质；3.将N-糖链从脱脂棉材料上洗脱后质谱分析。具体的，本专利技术的一种N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，基于脱脂棉材料基质，对N-糖链进行快速酶解释放，并原位富集N-糖链并质谱分析，其中，用脱脂棉材料作为含N-糖蛋白样品的吸取载体，N-糖链快速酶解释放的平台，以及固相富集时N-糖链的富集基体，实现N-糖链的快速释放与选择性富集，其包括步骤：(1)使用脱脂棉材料吸取含糖蛋白样品的溶液，加入合适的缓冲液使材料浸润，将材料置于离心管中保存；(2)对脱脂棉上糖蛋白样品进行高温快速PNGaseF去糖基化处理，使糖蛋白上的糖链释放出来；(3)加入一定体积有机溶剂调节样品溶液，使溶液中的糖链被脱脂棉材料吸附；(4)将脱脂棉材料填装至枪头中，然后将枪头置于离心管上；(5)将剩余的样品溶液转移至脱脂棉材料上，通过离心使得溶液和脱脂棉分离；(6)用合适的缓冲液清洗材料，每次清洗后通过离心将溶液和脱脂棉分开；(7)更换底部离心管，加入洗脱溶液，将糖链从材料上解离下来，通过离心收集溶液部分；(8)收集的溶液冻干后，可直接重溶后使用基质辅助激光解吸/电离质谱进行分析，或进行甲胺化反应以保护唾液酸单元；(9)甲胺化后的样品，通过加入一定体积有机溶剂调节后，使用步骤(4)-(7)的方法除盐，可使用基质辅助激光解吸/电离质谱进行分析。本专利技术中，采用脱脂棉材料为吸附剂，利用材料表面高密度羟基与具有高亲水性的N-糖链之间的氢键等相互作用，将N-糖链吸附在脱脂棉材料上，通过离心将脱脂棉材料与溶液分离，最终实现N-糖链的富集和质谱分析；本专利技术所述步骤(1)与(2)中，将蛋白质样品溶于10-50mM碳酸氢铵水溶液中，按照每份样品加入0.5μL的PNGaseF，在45-55摄氏度下混合0.5-1小时，使样品中的N-糖链从蛋白质上解离下；所述步骤(3)中，往酶解后的溶液中加入一定体积乙腈/三氟乙酸/水溶液，使溶液中乙腈体积分数在80-85％，TFA的体积分数为0-0.1％，体积在80-160μL；所述步骤(5)中，使用离心机将脱脂棉材料和溶液分离，弃去溶液部分；每次加液至离心之间的间隔为0.5-1分钟，离心的时间为10-30秒；所述步骤(6)中，用50-100μL乙腈/三氟乙酸(TFA)/水溶液(乙腈体积分数为75-85％，TFA体积分数为0-0.1％)清洗材料4-6次，每次清洗后使用离心机将脱脂棉材料和溶液分离，弃去溶液部分；每次加液至离心之间的间隔为0.5-1分钟，离心力为1500g，离心时间为10-30秒；所述步骤(7)中，用50-100μL的0-0.1％TFA水溶液洗脱糖链1-2次，每次洗脱后使用离心机将脱脂棉材料和溶液分离，收集溶液部分；每次加液至离心之间的间隔为0.5-1分钟，离心力为1500g，离心时间为10-30秒；所述步骤(8)中，在不进行甲胺化的情况下，洗脱收集的溶液与含有2,5-二羟基苯甲酸(DHB)的有机基质混合，进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析；所述步骤(8)中，在进行甲胺化的情况下，洗脱收集的溶液冻干后，加入10-15μL5M甲胺盐酸盐(溶于二甲亚砜DMSO)与10-15μL250mM(7-Azabenzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate(PyAOP)(溶于二甲亚砜：N-甲基吗啉＝7：3体系中)，在37摄氏度反应1-1.5小时；所述步骤(9)中，在甲胺化后的溶液中加入400-500μL的乙腈/三氟乙酸/水溶液与甲胺化后溶液混合，乙腈的体积分数为80-100％，TFA的体积分数为0-0.1％。本专利技术提供了一种基于脱脂棉材料基质对N-糖链进行快速酶解释放并原位富集N-糖链并质谱分析的方法；本专利技术方法利用脱脂棉的强吸附性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，采用基于脱脂棉的材料作为吸取糖蛋白样品溶液、快速酶解以及N-糖链固相富集的基质；其包括步骤：/n(1)使用脱脂棉材料吸取含糖蛋白样品的溶液，加入缓冲液使材料浸润，将材料置于离心管中保存；/n(2)对脱脂棉上糖蛋白样品高温快速PNGase F去糖基化处理，使糖蛋白上的糖链释放出；/n(3)加入一定体积有机溶剂调节样品溶液，使溶液中的糖链被脱脂棉材料吸附；/n(4)将脱脂棉材料填装至枪头中，并置放在离心管上；/n(5)将剩余的样品溶液转移至脱脂棉材料上，离心使溶液和脱脂棉分离；/n(6)用缓冲液清洗材料，清洗后离心将溶液和脱脂棉分开；/n(7)更换底部离心管，加入洗脱溶液，将糖链从材料上解离，离心收集溶液部分；/n(8)收集的溶液冻干后，直接重溶后用基质辅助激光解吸/电离质谱进行分析，或进行甲胺化反应以保护唾液酸单元；/n(9)甲胺化后的样品加入有机溶剂调节后，用步骤(4)-(7)的方法除盐，用基质辅助激光解吸/电离质谱分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种N-糖链快速酶解释放和固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，采用基于脱脂棉的材料作为吸取糖蛋白样品溶液、快速酶解以及N-糖链固相富集的基质；其包括步骤：
(1)使用脱脂棉材料吸取含糖蛋白样品的溶液，加入缓冲液使材料浸润，将材料置于离心管中保存；
(2)对脱脂棉上糖蛋白样品高温快速PNGaseF去糖基化处理，使糖蛋白上的糖链释放出；
(3)加入一定体积有机溶剂调节样品溶液，使溶液中的糖链被脱脂棉材料吸附；
(4)将脱脂棉材料填装至枪头中，并置放在离心管上；
(5)将剩余的样品溶液转移至脱脂棉材料上，离心使溶液和脱脂棉分离；
(6)用缓冲液清洗材料，清洗后离心将溶液和脱脂棉分开；
(7)更换底部离心管，加入洗脱溶液，将糖链从材料上解离，离心收集溶液部分；
(8)收集的溶液冻干后，直接重溶后用基质辅助激光解吸/电离质谱进行分析，或进行甲胺化反应以保护唾液酸单元；
(9)甲胺化后的样品加入有机溶剂调节后，用步骤(4)-(7)的方法除盐，用基质辅助激光解吸/电离质谱分析。


2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的糖蛋白样品浓度为10ng/μL—1000ng/μL，溶于10-50mM碳酸氢铵缓冲液中。


3.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中的糖蛋白样品，每份加入0.5μL的PNGaseF酶。


4.按...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆豪杰，张莹，彭叶，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31