一种单细胞基因组目标区域捕获的方法技术

本发明专利技术涉及一种单细胞基因组目标区域捕获的方法。具体的通过对单细胞基因组进行全基因组扩增，对扩增后的基因组进行打断、末端修复、3'端加A、加接头、PCR扩增、目标区域捕获、对目标区域捕获的DNA片段进行PCR扩增及测序。通过本发明专利技术提供的方法可以提高捕获测序结果的覆盖度，提高捕获结果的特异性。

A Method for Capturing Target Region of Single Cell Genome

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞基因组目标区域捕获的方法
本专利技术涉及一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，属于基因检测

技术介绍
单细胞测序在2011年被《NatureMethods》列为年度值得期待的技术之一，在2013年被《Science》列为年度最值得关注的六大领域榜首，其越来越受到科研工作者的青睐，相关的研究成果也井喷式地发表在各顶级期刊上，这些都表明，单细胞测序已逐渐成为科研热点。单细胞测序技术可以剖析细胞的异质性，揭示肿瘤细胞基因组中发生的变异。有助于我们描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展和扩散范围。目前该技术已广泛地应用在辅助生殖、癌症、神经学和免疫学等领域。单细胞目标区域捕获测序是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后定制目标基因组区域的探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的技术手段。单细胞目标区域测序技术用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系，也有助于发现和验证疾病特别是癌症的相关候选基因或相关位点，在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力[1]。目标区域捕获测序的优势在于只对感兴趣的基因组区域进行研究，而且在获得相同数据量时测序深度更深，结果更准确；而且与常规基因组测序相比，其不仅费用较低，数据阐释也更为简单。单细胞基因组目标区域捕获测序相较于正常样本(无需扩增基因组，基因组的量足够进行目标区域捕获测序的样本)基因组的目标区域捕获测序的效果还是有明显区别的。首先，单细胞基因组只有两个拷贝，总量约6pg。在扩增过程中，可能无法重现完整的基因组。其次，假如丢失的部分恰是芯片探针的区域，那么就会影响捕获特异性，造成数据量浪费。而且在相同测序深度下，单细胞目标区域捕获测序的靶区域覆盖度较普通基因组的要低。参考文献[1]Wang,Y.etal.Clonalevolutioninbreastcancerrevealedbysinglenucleusgenomesequencing.Nature512,155–160(2014).
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，通过优化全基因组扩增流程、文库构建流程以及目标区域捕获流程，从而提高捕获测序结果的覆盖度和捕获结果的特异性。1.一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行等温扩增，获得扩增后的基因组；步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤I：将PCR扩增产物进行测序；其中，所述步骤A中等温扩增的条件为30℃反应2小时；所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应16～24小时。2.根据项1所述方法，其中，所述步骤A之后还包括：步骤A-1：使用核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:44所示的引物对扩增后的基因组进行PCR扩增。3.根据项1或2任一项所述的方法，其中，所述步骤F中加接头的DNA片段的量为100～250ng。4.根据项1或2任一项所述的方法，其中，所述步骤F中加接头的DNA片段的量为150～200ng。5.根据项1～4任一项所述的方法，其中，所述步骤F中PCR扩增的循环数为5个循环。6.根据项1～5任一项所述的方法，其中，所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应24小时。7.根据项1所述的方法，其中，所述步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、步骤E与步骤F之间、步骤F与步骤G之间、步骤G与步骤H之间、步骤H与步骤I之间，和/或在步骤I之后包括对DNA片段进行纯化的步骤。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，专利技术提供了一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，通过优化全基因组扩增流程、文库构建流程以及目标区域捕获流程，缩短了捕获测序的时间，提高了捕获测序结果的覆盖度和捕获结果的特异性。具体实施方式以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，获得扩增后的基因组；步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤I：将PCR扩增产物进行测序；其中，所述步骤A中扩增的条件为30℃反应2小时；所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应16～24小时。所述多重置换扩增方法，可以参见例如美国专利US6,124,120。该多重置换扩增方法通常包括使一组引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述靶核酸的扩增反应以复制该靶核酸；就单细胞基因组扩增而言，通常认为需要更长的扩增反应时间，例如用于单细胞基因组扩增的REPLI-gSingleCellKit(Qiagen公司)的操作说明书中规定的扩增反应时间为8小时。但本专利技术的专利技术人研究发现，当扩增反应时间超过2小时时，扩增反应产物的产量已经达到基本饱和，优选的，所述扩增时间为2小时。优选地，步骤A之后还包括步骤A-1：使用核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:44所示的引物对扩增后的基因组进行PCR检测，进一步检测扩增后的基因组的完整性，有效避免使用扩增效果差的扩增后的基因组进行建库，以及后续研究产生带来的时间及成本的浪费。常规的文库构建方法中，为了满足文库质控，上机测序以及其他的检测的需求，通常认为文库构建的起始量为100ng～2μg。例如TruSeqNanoDNA试剂盒(Illumina公司)操作说明书建议的文库起始量为100～200ng，TruSeqDNAPCR-Free试剂盒(Illumina公司)操作说明书中建议的文库起始量为1～2μg。在本专利技术中，专利技术人发现通过提高文库起始量能够提高基因组中目标区域的覆盖度，优选地，所述文库起始量为3μg。所述步骤B使用超声或酶切方法进行打断，以及其他本领域技术人员已知的打断方法均可在本步骤中使用。所述步骤C使用缓冲液、T4DNAPolymerase、KlenowDNAPolymerase、T4polynucleotideKinase、dNTP进行末端修复，反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行等温扩增，获得扩增后的基因组；步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤I：将PCR扩增产物进行测序；其中，所述步骤A中等温扩增的条件为30℃反应2小时；所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应16～24小时。

【技术特征摘要】
2017.12.26 CN 20171143145061.一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行等温扩增，获得扩增后的基因组；步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤I：将PCR扩增产物进行测序；其中，所述步骤A中等温扩增的条件为30℃反应2小时；所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；所述步骤G中目标区域捕获的条...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪燕，惠峰，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11