The present invention relates to a library construction method suitable for ATAC_seq sequencing technology in cell lines and animal tissues. The methods include: 1) collecting cells or animal tissues to prepare cell suspension; 2) adding NP40-containing lysate to lyse cell membranes to obtain cell nuclei and purify them; 3) collecting cell nuclei for quantitative and nuclear integrity detection; 4) adding Tn5 transposase into intact cell nuclei; Transposon reaction and purification; 5) PCR amplification, construction of second-generation library and purification; 6) high-throughput sequencing to obtain gene data. Based on the sensitivity of transposable enzymes to DNA content, this method can be used to quantify DNA content directly. It has wide applicability, especially for the construction of libraries of rare and poorly preserved species or tissues. At the same time, the recycled nucleus can be used as the transposase of Tn5 developed by domestic vazyme company through the pre-optimization of the present invention, and good experimental results are obtained, so that ATAC_seq is no longer restricted by the type of transposase.
【技术实现步骤摘要】
一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法
本专利技术涉及分子生物学
,更具体地,涉及一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法。
技术介绍
核小体是真核细胞染色质的基本结构单位,由DNA和组蛋白构成。每个核小体由146bp的DNA缠绕在八聚体的组蛋白上形成,两个核小体之间通过一段连接DNA相连,DNA与组蛋白的结合可以发生动态变化。缠绕在组蛋白上的DNA不易与其它蛋白结合,这些DNA通常处于表达抑制状态。没有核小体结合的开放的DNA区域易于与调控蛋白相结合,则可以使其下游的基因处于活跃表达的状态。细胞通过改变DNA与组蛋白的结合位置,从而调控基因的表达。因此,获得处于开放状态的DNA序列可用于研究基因表达的调控机制,是表观遗传学研究的热点,而ATAC-seq则是用于这类研究的最佳利器。ATAC-seq技术是一种表观遗传学研究技术,通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割,获得在该时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。然而,现有技术中绝大多数ATAC-seq实验都是首先通过流式细胞分选技术(FACS)收集50,000个活细胞或者使用流式细胞核分选(FANS)筛选50,000个细胞核进行实验,此项技术所需的工作量较大,成本太高,受众很窄,不适用于普通实验室大量进行ATAC-seq实验。再次,针对起始量的问题,几乎所有ATAC-seq实验要求的起始量都是50,000个细胞,但是不同生物50,000个细胞所含的DNA数量完全不一样,视该生物的基因组大小而定,且所有的参考文献都是使用DAPI对细胞核进行 ...
【技术保护点】
1.一种适用于细胞系和动物组织ATAC‑seq测序技术的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)收集细胞或动物组织,制备细胞悬液;(2)加入含NP40的裂解液,裂解细胞膜,获得细胞核并纯化;(3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测;(4)完整细胞核中加入Tn5转座酶进行转座反应并纯化;(5)PCR扩增,构建二代文库并纯化;(6)进行高通量测序,得到基因数据。
【技术特征摘要】
1.一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)收集细胞或动物组织,制备细胞悬液;(2)加入含NP40的裂解液,裂解细胞膜,获得细胞核并纯化;(3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测;(4)完整细胞核中加入Tn5转座酶进行转座反应并纯化;(5)PCR扩增,构建二代文库并纯化;(6)进行高通量测序,得到基因数据。2.根据权利要求1所述的一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法,其特征在于,所述细胞悬液制备方法为:对于细胞系,收集含有105个细胞的细胞沉淀;对于组织样,取0.05g组织进行液氮研磨,将所述沉淀用预冷的RSB混合液重悬;所述RSB混合液包括10mMTris-HCl、10mMNaCl、3mMMgCl2。3.根据权利要求1所述的一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中裂解液包括10mMTris-HCl、10mMNaCl、3mMMgCl2、0.5vol%NP40、0.1vol%Tween-20和1×proteaseinhibitor;所述步骤(2)中裂解进行以下处理:细胞悬液加入预冷的裂解液,轻弹混匀沉淀;置于4℃冰箱中的旋转混匀仪上,冰上孵育5min后4℃500g离心5min,去除上清...
【专利技术属性】
技术研发人员:严琰,
申请(专利权)人:嘉兴菲沙基因信息有限公司,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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