一种病毒类疫苗种子的深度测序方法技术

本发明专利技术涉及一种病毒类疫苗种子的深度测序方法，结合了离心、过滤、超速离心和酶消化等步骤，经处理的样品不经PCR反应即可建库并深度测序。本发明专利技术的有益效果：本发明专利技术的病毒类疫苗种子的深度测序方法，具有样品需求量少，测序总成本低，数据中有效数据比例高，测序平均深度大的特点。

A Deep Sequencing Method for Viral Vaccine Seeds

The present invention relates to a deep sequencing method for virus vaccine seeds, which combines centrifugation, filtration, ultracentrifugation and enzyme digestion steps. The processed samples can be stored and sequenced in depth without PCR reaction. The invention has the advantages of low sample demand, low total sequencing cost, high proportion of effective data in data and large average sequencing depth.

【技术实现步骤摘要】
一种病毒类疫苗种子的深度测序方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种病毒类疫苗种子的深度测序方法。
技术介绍
疫苗生产中，疫苗种子的基因序列信息和疫苗的传代稳定性是保证疫苗质量的关键指标。使用深度测序方法检测疫苗种子或传代产物的基因序列信息时，现有的病毒类疫苗种子深度测序方法是采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增目标病毒，使用扩增产物建库测序，而PCR过程本身可造成结果偏差，影响实验结果。或采用不经扩增直接测序的方法，但直接测序所需的测序数据量极大，病毒基因的测序绝对数量少，测序成本极高。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种病毒类疫苗种子的深度测序方法，具有样品需求量少，测序总成本低，测序平均深度较深的特点。本专利技术的目的是提供一种病毒类疫苗种子的深度测序方法。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，所述方法包括以下步骤：(1)将待测序样本进行离心，保留上清液；(2)采用滤膜对步骤(1)得到的所述上清液进行过滤，形成滤过液；(3)将步骤(2)得到的所述滤过液进行超速离心，除去上清液，保留沉淀；(4)向步骤(3)得到的所述沉淀中加入纯水或缓冲液，使所述沉淀悬起，再加入酶，混合均匀并反应，形成处理后的样本；(5)采用酚氯仿抽提法提取步骤(4)得到的所述处理后的样本中的核酸，然后建库，测序。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其中，步骤(1)中，所述离心的转速为4000-15000转/分钟，所述离心的时间为5-90分钟。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其中，步骤(2)中，所述滤膜的孔径为0.22-0.45μm。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其中，步骤(3)中，所述超速离心的转速为20000-800000×g，所述超速离心的时间为2-8小时。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其中，步骤(4)中，所述酶为DNA酶和RNA酶。所述DNA酶的添加量为20-200U/mL，所述RNA酶的添加量为1500-3000U/mL。优选的，先加入DNA酶酶解半小时，再加入RNA酶酶解半小时。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其中，步骤(5)中，采用酚氯仿抽提法提取所述处理后的样本中的核酸前，先用Trizol对所述处理后的样本进行处理。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，进一步的，步骤(5)中，向所述处理后的样本中加入Trizol，混匀后室温放置4-6min，加入氯仿，混匀后室温放置2-4min，然后离心；将上层无色水相转移至另外的离心管中(此步绝对不能吸入中间白膜层)，加入异丙醇，室温放置8-12min，然后再次离心8-12min，弃去上清，得到RNA胶样沉淀；用乙醇洗涤所述RNA胶样沉淀，离心后去掉上清保留沉淀，室温放置10-15min，干燥，加入DEPC水溶解RNA沉淀即可。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，更进一步的，向所述处理后的样本中加入2-4倍体积的Trizol，剧烈震荡15S，并在室温放置5min，每0.75mL所述处理后的样本中加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15S，室温放置3min，然后在4℃下12000×g离心15min使样品分为3层：上层为无色水相，下层为粉红色有机相，中间为白膜层。优选的，加入向所述处理后的样本中加入3倍体积的Trizol。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，更进一步的，所述Trizol的添加量与所述处理后的样本的体积比为3:1。根据本专利技术的具体实施方式的病毒类疫苗种子的深度测序方法，进一步的，将上层无色水相转移至DEPC处理过的1.5mLEP管中，每0.75mL所述处理后的样本中加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，而后在4℃下，12000×g离心10min，弃去上清，用75％乙醇洗涤RNA胶样沉淀，在4℃下，7500×g离心5min，室温放置10-15min干燥，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀后-80℃保存。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术的病毒类疫苗种子的深度测序方法应用于疫苗生产中病毒类疫苗种子的序列测定，在建库步骤之前采用新的样品处理方法，结合了离心、过滤、超速离心和酶消化等步骤，经处理的样品不经PCR反应即可建库并深度测序，同时保证测序得到的总数据中，疫苗种子的基因比例较高(不少于90％)，分析后的数据中疫苗种子的测序平均深度较深(不少于40000×)；(2)本专利技术具有样品需求量少，测序总成本低，数据中有效数据比例高，测序平均深度大、覆盖度高，测序结果无特异性引物干扰，偏倚小的特点。附图说明图1显示本专利技术的深度测序方法与PCR产物测序方法对轮状病毒LLR进行测序，在引物结合区是否存在突变；图2为显示本专利技术的深度测序方法与PCR产物测序方法对脊髓灰质炎病毒sabin3型进行测序，变异程度分析。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。实施例1本实施例提供了一种病毒类疫苗种子的深度测序方法，所述方法包括以下步骤：(1)将待测序样本进行离心，保留上清液；(2)采用滤膜对步骤(1)得到的所述上清液进行过滤，形成滤过液；(3)将步骤(2)得到的所述滤过液进行超速离心，除去上清液，保留沉淀；(4)向步骤(3)得到的所述沉淀中加入PBS缓冲液，使所述沉淀悬起，再加入酶，混合均匀并反应，形成处理后的样本；(5)采用酚氯仿抽提法提取步骤(4)得到的所述处理后的样本中的核酸，然后建库，测序。实施例2本实施例提供了一种病毒类疫苗种子的深度测序方法，所述方法包括以下步骤：(1)将待测序样本进行4000转/分钟离心5分钟，保留上清液；(2)采用孔径为0.45μm的滤膜对步骤(1)得到的所述上清液进行过滤，形成滤过液；(3)将步骤(2)得到的所述滤过液进行20000×g超速离心8小时，除去上清液，保留沉淀；(4)向步骤(3)得到的所述沉淀中加入纯水，使所述沉淀悬起，再加入80U/mL的DNA酶进行酶解，然后添加2000U/mL的RNA酶进行酶解，形成处理后的样本；(5)向步骤(4)得到的所述处理后的样本中加入2-4倍体积的Trizol，剧烈震荡15S，混匀后室温放置5min，每0.75mL所述处理后的样本中加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15S，混匀后室温放置3min，然后4℃12000×g离心15min使样品分为3层：上层为无色水相，下层为粉红色有机相，中间为白膜层；将上层无色水相转移至另一DEPC处理过的1.5mLEP管中，每0.75mL所述处理后的样本中加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，然后在4℃下，12000×g离心10min，弃去上清，得到RNA胶样沉淀；用75％的乙醇洗涤所述RNA胶样沉淀，在4℃下，7500×g离心5min，室温放置13min，干燥，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀后-80℃保存，然后建库，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将待测序样本进行离心，保留上清液；(2)采用滤膜对步骤(1)得到的所述上清液进行过滤，形成滤过液；(3)将步骤(2)得到的所述滤过液进行超速离心，除去上清液，保留沉淀；(4)向步骤(3)得到的所述沉淀中加入纯水或缓冲液，使所述沉淀悬起，再加入酶，混合均匀并反应，形成处理后的样本；(5)采用酚氯仿抽提法提取步骤(4)得到的所述处理后的样本中的核酸，然后建库，测序。

【技术特征摘要】
1.一种病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将待测序样本进行离心，保留上清液；(2)采用滤膜对步骤(1)得到的所述上清液进行过滤，形成滤过液；(3)将步骤(2)得到的所述滤过液进行超速离心，除去上清液，保留沉淀；(4)向步骤(3)得到的所述沉淀中加入纯水或缓冲液，使所述沉淀悬起，再加入酶，混合均匀并反应，形成处理后的样本；(5)采用酚氯仿抽提法提取步骤(4)得到的所述处理后的样本中的核酸，然后建库，测序。2.根据权利要求1所述的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的转速为4000-15000转/分钟，所述离心的时间为5-90分钟。3.根据权利要求1所述的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，步骤(2)中，所述滤膜的孔径为0.22-0.45μm。4.根据权利要求1所述的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超速离心的转速为20000-800000×g，所述超速离心的时间为2-8小时。5.根据权利要求1所述的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，步骤(4)中，所述酶为DNA酶和RNA酶。6.根据权利要求1所述的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，步骤(5)中，采用酚氯仿抽提法提取所述处理后的样本中的核酸前，先用Trizol对所述处理后的样本进行处理。7.根据权利要求6所述的病毒类疫苗种子的深度测序方法，其特征在于，步骤(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晴川，国泰，赵荣荣，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11