一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法技术

本发明专利技术涉及基础研究（基因表达调控、生物进化、种属鉴定、基因分型）和应用研究（药物开发、法医鉴定、食药品安全监管、海关检验检疫等）领域中的高特异性核酸检测，具体涉及到一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法。该检测试剂的主要成分包括检测目标核酸链的特异性探针和可以降解核酸单链的单链核酸酶。本发明专利技术的高特异性核酸检测试剂操作简便、快速便捷、性价比高，可以满足自动化的需要，省时省力，便于实现规模化实验和基础研究。

A highly specific nucleic acid detection reagent and its application

The present invention relates to high specificity nucleic acid detection in basic research (gene expression regulation, biological evolution, species identification, genotyping) and Application Research (drug development, forensic identification, food and drug safety supervision, customs inspection and quarantine, etc.), in particular to a high specificity nucleic acid detection reagent and its use method. The main components of the detection reagent include specific probes for detecting target nucleic acid chains and single-stranded nuclease which can degrade single-stranded nucleic acid. The high specific nucleic acid detection reagent of the invention has the advantages of simple operation, fast and convenient operation, high performance-price ratio, meeting the needs of automation, saving time and labor, and facilitating large-scale experiments and basic research.

【技术实现步骤摘要】
一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法
本专利技术涉及基础研究（基因表达调控、生物进化、种属鉴定、基因分型）和应用研究（药物开发、法医鉴定、食药品安全监管、海关检验检疫等）领域中的高特异性核酸检测，具体涉及到一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法。
技术介绍
现代生物学（植物学、动物学、微生物学、海洋生物学、古生物学、古人类学等）的重要研究内容之一是核酸鉴定和核酸检测。完整的基因组信息可以使人类在基因水平上对地球上已经灭绝的和现存的各种各样物种的起源、进化、迁徙以及灭亡进行深层次、多视角、全方位的分析和解读，因为基因组的核苷酸序列以及核苷酸变异决定了物种特征和物种进化。核酸检测的基本原理是利用碱基互补配对原则。基于基因组信息设计的核酸探针与待检测的目标核酸片段形成稳定的杂交双链，然后利用体外扩增技术将与核酸探针结合的微量目标核酸片段扩增到易于检测的水平。核酸检测的成功取决于杂交双链的稳定性，而杂交双链的稳定性受到核酸链的长度、核酸链的核苷酸组分以及序列、溶液中的离子强度、杂交温度以及杂交双链的碱基互补度等因素的影响。在其他条件固定的条件下，杂交双链的碱基互补度越高，其杂交双链的稳定性也越高，即检测特异性越高。但是，当目标核酸片段的核苷酸序列和非目标核酸片段的核苷酸序列之间仅仅相差一个或几个核苷酸时，核酸探针就难于区分目标核酸链和非目标核酸片段，由此产生了假阳性检测信号。这样的假阳性结果给检测具有细微的核苷酸变异提出了巨大的挑战。细微的核苷酸变化包括基因的单点突变、单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，简称SNP）、甲基化、微RNA（microRNA）家族成员等。这些细微的核苷酸变异不仅可以影响基因水平的变化，而且还可以在表观遗传水平上影响物种特性。目前常用的检测这些细微的单核苷酸变化的方法有核酸测序（sequencing）、高分辨溶解曲线（highresolutionmelting，简称HRM）、限制性酶切片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，简称RFLP）、单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism，简称SSCP）、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交（allelespecificoligonucleotidehybridization，简称ASO）、等位基因特异性PCR（allelespecificPCR）等。虽然这些技术在某种程度上可以对SNP、单点突变等进行检测，但是它们存在一定的技术缺陷。例如，核酸测序被认为是核酸检测的金标准，但是核酸测序的技术含量高，需要专业技术人员操作，测序费用高，不易于普及。SSCP和RFLP必须通过凝胶电泳进行检测，难于满足自动化的需要，耗时费力，不便于实现规模化实验。等位基因特异PCR则面临着引物设计合理性的限制。近年来，人们还利用核酸与蛋白质相互作用专利技术了SNP和单点突变的检测技术，如基于单链核酸酶的检测方法。但是，这些方法都需要首先对待测核酸进行PCR扩增，然后再利用核酸酶将PCR扩增产物水解成为不同的片段，从而影响了核酸检测的高特异性。因此，无论是基础研究还是实际应用，人们迫切需要高特异性的核酸检测方法和技术。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种高特异性核酸检测试剂及其使用方法。为了实现本专利技术的目的，提供以下技术方案。一种高特异性核酸检测试剂，该检测试剂的主要成分包括检测目标核酸链的特异性探针和可以降解核酸单链的单链核酸酶。一种高特异性核酸检测试剂使用方法，具体包括下列步骤。步骤一：将特异性探针①与含有待检测的核酸链②加入到反应缓冲液中，进行变性退火。步骤二：将单链核酸酶加入到反应缓冲液中，在优化温度下孵育特定时间，其优化温度取决于特异性探针的探针长度、构成特异性探针的核苷酸组分与类型、以及单链核酸酶的最适工作温度；其反应时间取决于单链核酸酶的酶切效率。步骤三：反应结束后，将反应体系在95℃孵育20分钟。步骤四：将反应体系自然降温到室温。步骤五：将单链核酸酶处理过的反应体系进行核酸检测。进一步，所述的检测目标核酸链的特异性探针是长度不少于十个、不多于三十个核苷酸的核酸单链；特异性探针可以与待检测的核酸链上的片段形成杂交核酸双链；构成特异性探针的核苷酸可以是核苷酸、脱氧核苷酸以及核苷酸衍生物，包括但不限于锁核酸、肽核酸、硫核酸、双脱氧核苷酸、甲氧基核苷酸等。进一步，所述的可以降解核酸单链的单链核酸酶，具有降解杂交核酸双链中的非双链结构的核酸酶。进一步，所述的非双链结构的核酸酶，非双链结构包括不符合标准碱基配对（A:T、A:U和G:C）原则的碱基对，或由于核苷酸插入或缺失形成的泡状结构或环状结构，或核酸双链的单链缺口。进一步，所述的可以降解核酸单链的单链核酸酶，包括但不限于S1核酸酶（S1Nuclease）、绿豆芽核酸酶（MungBeanNuclease）、P1核酸酶（P1Nuclease）、BAL31核酸酶（BAL31Nuclease）、核糖核酸酶A（RibonucleaseA）、芹菜核酸酶（CELINuclease）等。进一步，所述的待检测的核酸链，可以是核酸双链或核酸单链，可以是长核酸链或寡核酸片段，可以是线性核酸链或环形核酸链。所述的待检测的核酸链可以是DNA链、RNA链或含有核苷酸衍生物的核酸链。进一步，所述的将单链核酸酶处理过的反应体系进行核酸检测，检测技术包括任何一种依赖于核酸扩增方法的检测技术或不依赖于核酸扩增方法的检测技术。进一步，所述的依赖于核酸扩增方法的检测技术，检测技术可以是基于热循环核酸扩增技术或基于恒温核酸扩增技术。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果。1）优良的检测特异性：该核酸检测试剂将首先直接与待测核酸样品进行反应，保持了待测样品核酸序列的原生状态，避免了现有技术的先扩增后辨识的策略，因此可以实现高保真性的特异性检测。2）巨大的样品处理能力：该核酸检测试剂可以对多种不同种类的核酸样品进行检测，待测的核酸样品可以是核酸双链或是核酸单链，可以是DNA链或是RNA链，可以是较长的核酸链或是很短的寡核酸片段（例如microRNA）。这是目前任何一种核酸检测技术所不可及的。3）检测成本低廉：该核酸检测试剂成本低廉，检测方法易于操作，不需要经过专业技术人员操作。可以与裸眼化检测方法相结合，实现不需要仪器设备的低成本检测，从而实现实时和实地的核酸检测。附图说明图1是高特异性核酸检测试剂的工作原理示意图。其中①：特异性探针；②待检测的核酸链；完全互补的杂交双链；：非完全互补的杂交双链；：单链核酸酶。图2是利用滚环扩增技术（RCA）检测高特异性核酸检测试剂处理的microRNAlet-7家族成员的流程图。其中①：特异性探针probe7E；②待检测的核酸链let-7a~let-7f；完全互补的杂交双链probe7E/let-7e；：非完全互补的杂交双链probe7E/let-7（不包括let-7e）；：单链核酸酶CELI；：环形模板；：具有链置换功能的DNA聚合酶phi29。步骤一：将特异性探针probe7E①与含有待检测的核酸链的样品混合。变性退火特异性探针①与待检测的let-7家族成员②成为杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高特异性核酸检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂的主要成分包括检测目标核酸链的特异性探针和可以降解核酸单链的单链核酸酶。

【技术特征摘要】
1.一种高特异性核酸检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂的主要成分包括检测目标核酸链的特异性探针和可以降解核酸单链的单链核酸酶。2.一种高特异性核酸检测试剂的使用方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一：将特异性探针①与含有待检测的核酸链②加入到反应缓冲液中，进行变性退火；步骤二：将单链核酸酶加入到反应缓冲液中，在优化温度下孵育特定时间，其优化温度取决于特异性探针的探针长度、构成特异性探针的核苷酸组分与类型、以及单链核酸酶的最适工作温度；其反应时间取决于单链核酸酶的酶切效率；步骤三：反应结束后，将反应体系在95℃孵育20分钟；步骤四：将反应体系自然降温到室温；步骤五：将单链核酸酶处理过的反应体系进行核酸检测。3.如权利要求1所述的高特异性核酸检测试剂，其特征在于，所述的检测目标核酸链的特异性探针是长度不少于十个、不多于三十个核苷酸的核酸单链；特异性探针可以与待检测的核酸链上的片段形成杂交核酸双链；构成特异性探针的核苷酸可以是核苷酸、脱氧核苷酸以及核苷酸衍生物，包括但不限于锁核酸、肽核酸、硫核酸、双脱氧核苷酸、甲氧基核苷酸。4.如权利要求1所述的高特异性核酸检测试剂，其特征在于，可以降解核酸单链的单链核酸酶具有降解杂交核酸双链中的非双链结构的核酸酶。5.如权利要求1所述的高特异性核酸检测试剂，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，关一夫，袁莹，李硕，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21