基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，具体是一种用于探测核酸自由末端高级结构的单分子力谱方法，属于生物大分子高级结构的力学精密测量领域。首先通过结合反应将携带修饰基团的待测核酸链锚定于DNA单链引物上，生成分叉引物；其次通过聚合酶链式反应制备携带待测核酸链的DNA以及救生绳DNA片段；再次通过酶切连接生成携带多条待测核酸的救生绳DNA结构物，并将其固定于两个表面之间；最后使用单分子力谱探测待测核酸自由末端形成的高级结构的动态变化。本发明专利技术设计的救生绳DNA，主要用于重复、主动、精密和实时测量核酸末端高级结构，拓展了单分子力谱的应用范围。

Detection of End Structure of Nucleic Acids Based on Single Molecular Force Spectroscopy

The invention relates to a method for detecting the terminal structure of nucleic acid based on single molecule force spectrum, in particular to a single molecule force spectrum method for detecting the advanced structure of free terminal of nucleic acid, which belongs to the field of mechanical precision measurement of the advanced structure of biological macromolecules. Firstly, the DNA strands containing modified groups were anchored to DNA single-stranded primers to generate bifurcated primers; secondly, DNA fragments carrying DNA strands and lifeline DNA fragments were prepared by polymerase chain reaction; secondly, lifeline DNA fragments carrying multiple DNA strands were generated by enzymatic cleavage and fixed between the two surfaces; lastly, single molecule was used. Force spectroscopy was used to detect the dynamic changes of advanced structures formed at the free end of nucleic acid to be measured. The lifeline DNA designed by the invention is mainly used for repetitive, active, precise and real-time measurement of advanced structure of nucleic acid terminal, and expands the application scope of single molecule force spectrum.

【技术实现步骤摘要】
基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法
本专利技术涉及一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，具体是一种用于探测核酸自由末端高级结构的单分子力谱方法，属于生物大分子二级以上三维构象或高级结构的力学精密测量领域。
技术介绍
核酸自由末端的高级结构动态组装研究是RNA结构与功能、染色质损伤修复通路以及端粒生物学领域的重要内容。如果能够精密、实时、主动和可重复探测核酸自由末端的高级结构的分子动态，就可以预测RNA加工、染色质损伤的修复和易位，以及染色体数目异常等细胞事件，从而深入理解核酸相关疾病或者端粒综合征的病理生理过程和分子生物学机制。目前可用于核酸自由末端高级结构动态组装研究的主要实验手段有：双向凝胶电泳、荧光原位杂交、电镜、超分辨显微镜、原子力显微镜和单分子荧光共振能量转移等。其中电泳和杂交等技术方法能够分离核酸高级结构的不同构象，并且探测核酸自由末端形成的拓扑结构，但是无法达到精密的时空分辨率，也无法对大分子施加外部能量进行可重复的主动探测。电镜、超分辨显微镜和原子力显微镜可以对众多大分子进行精密成像，通过多样本统计进而分析高级结构的非均一组份，但是无法进行实时监测，也无法进行可重复的主动探测。单分子荧光共振能量转移可以高通量探测核酸自由末端的动态构象变化，实现毫秒时间分辨率，但是荧光共振能量转移的适用距离是1-10纳米，不能探测大尺度的分子构象动态，也无法对目标分子施加外力进行可重复的主动探测。单分子力谱是精密、实时、主动、重复探测大分子多态构象变化的最有效手段之一。常用的单分子力谱技术有光镊、原子力显微镜和磁镊等。单分子力谱可以表征多态大分子的非均一构象，尤其是超出荧光共振能量转移检测距离的长链核酸或蛋白。单分子力谱通常能够以毫秒和纳米的时空分辨率探测分子的动态变化。更重要的是，单分子力谱可对目标分子施加外力，从而进行主动探测。单分子力谱目前仅有重复探测末端固定的核酸结构的实验方案，没有简便易行的可重复探测核酸自由末端高级结构动态的实验方法。中国专利CN200710065562.4公开了一种结合磁镊观测生物大分子的全反射近场显微镜，在高分辨率、高精度下实时快速的观察生物大分子。到目前为止，基于单分子力谱探测核酸末端动态的结构的方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，可以精密、实时、主动和可重复探测核酸自由末端高级结构。通过结合反应，合成携带待测核酸序列的分叉引物，然后使用分叉引物进行聚合酶链式反应，从而可将两条以上的待测核酸序列锚定于DNA救生绳结构上。多条核酸链的自由末端相互作用，形成待测高级结构。通过亲和反应，将携带待测核酸链的DNA救生绳结构物固定于两个表面之间。通过对救生绳施加外力，从而获得待测核酸高级构象变化的力学动态轨迹。以轨迹的空间变量作为外力或者时间的函数，本专利技术可用于探测核酸自由末端高级结构的动态机制。本专利技术提供的基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法具体包括如下步骤：1）待测核酸链的一端携带能进行结合反应的修饰基团，用于锚定在DNA救生绳上；无修饰的另一端为核酸的自由末端，将形成待探测的结构；DNA引物中间位置的修饰基团与待测核酸链进行结合反应，产物是分叉引物；2）分叉引物经分离、纯化后用于聚合酶链式反应；3）救生绳DNA片段为不携带待测核酸链的聚合酶链式反应产物；4）救生绳结构物终产物的制备是将携带待测核酸的聚合酶链式反应产物与救生绳DNA片段相间排列，使用连接酶进行共价连接，位于结构物终产物两端的救生绳片段携带亲和性修饰，用于在探测表面锚定结构物；所述的探测表面是微球表面、玻璃表面、原子力显微镜探针或基底表面。5）单分子力谱对锚定于两个表面之间的救生绳DNA结构物施加外力，探测待测核酸形成的高级结构，收集包含三维空间位置、力和时间的轨迹数据。步骤1）所述的结合反应是点击化学、酶促连接或者亲和结合。修饰基团取决于选取的结合反应。分叉引物包含两条单链核酸，其一是待测核酸链，其二是可以进行聚合酶链式反应的DNA引物。步骤2）所述的聚合酶链式反应的引物之一为分叉引物，携带待测核酸单链。步骤2）所述分离的技术常选凝胶电泳，例如含有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化技术可以是切胶回收和乙醇沉淀。链式反应的聚合酶有多种选择，优选Takara公司的DNA聚合酶（PrimeSTARGXLDNAPolymerase）。分叉引物及其配对引物确定DNA产物长度。待测核酸和聚合酶链式反应DNA产物之间无特异性相互作用。步骤3）所述救生绳片段是双链DNA，所述的救生绳DNA片段的数目大于待测核酸链条数；救生绳DNA片段长于其构象持续长度或相关长度，也要长于待测核酸多态构象的最大长度。步骤4）所述的结构物是指单分子力学实验中将操控辅助核酸片段与待测核酸结构连接制备的核酸分子。救生绳结构物两端的亲和性修饰是单位点或者多位点修饰，可选用生物素或地高辛，所述救生绳结构物终产物的共价连接可选用T4DNA连接酶。单位点修饰通过引物标记实现。在脱氧核苷酸混合液中掺入生物素或地高辛修饰的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，通过聚合酶链式反应可在救生绳DNA片段的多个位点引入修饰。探测表面可以是微球表面、玻璃表面、原子力显微镜探针或者基底表面。步骤5）所述的单分子力谱是但不限于磁镊、光镊和原子力显微镜。所述的待测核酸形成的高级结构是但不限于T-loop、D-loop或R-loop。本专利技术提供了一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，设计了救生绳DNA，可以精密、实时、主动和可重复探测核酸自由末端高级结构，拓展了单分子力谱的应用范围。附图说明图1是以点击化学为例制备携带多条待测核酸的救生绳DNA结构物流程图。图2是点击化学反应和救生绳DNA结构物连接反应的凝胶电泳结果图。(A)是分叉引物1制备结果图。待测核酸链1和中间炔基修饰DNA引物1进行点击化学反应，然后使用聚丙烯酰胺变性凝胶（8%，7M尿素）进行电泳分离，经乙醇沉淀获得分叉引物1。(B)是分叉引物2制备结果图。待测核酸链2和中间炔基修饰DNA引物2进行点击化学反应，然后使用聚丙烯酰胺变性凝胶（8%，7M尿素）进行电泳分离，经乙醇沉淀获得分叉引物2。(C)是将分叉引物2与生物素修饰上游引物进行分叉聚合酶链式反应获得单位点生物素修饰且携带待测核酸2的DNA片段，分叉引物1与地高辛修饰下游引物进行分叉聚合酶链式反应获得单位点地高辛修饰且携带待测核酸1的DNA片段，以及救生绳片段。通过限制性内切酶酶切后，T4DNA连接酶连接形成救生绳DNA结构物。图3是以单分子磁镊为例重复、主动和实时探测核酸末端高级结构的实验设置示意图和两种轨迹数据。(A)是磁镊实验中分子结构示意图。当救生绳DNA结构物分子不受力时，待测核酸1和待测核酸2配对形成T-loop高级结构（右图）。当施加足够大的力时，T-loop高级结构被打开，即待测核酸1和待测核酸2分开成为2条单链。(B)是对同一个救生绳DNA结构物分子进行5次反复拉伸。(C)的上图是待测核酸1和待测核酸2形成普通的双链配对，力跳实验时双链迅速分开；中图为待测核酸1和待测核酸2形成T-loop高级结构，力跳实验时产生停顿信号；下图为力跳实验时，力随时间变化的形式。具体实施方式下面结合具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，其特征在于包括以下步骤：1）待测核酸链的一端携带能进行结合反应的修饰基团，用于锚定在DNA救生绳上；无修饰的另一端为核酸的自由末端，将形成待探测的结构；DNA引物中间位置的修饰基团与待测核酸链进行结合反应，产物是分叉引物；2）分叉引物经分离纯化后用于聚合酶链式反应；3）救生绳DNA片段为不携带待测核酸链的聚合酶链式反应产物；4）救生绳结构物终产物的制备是将携带待测核酸的聚合酶链式反应产物与救生绳DNA片段相间排列，使用连接酶进行共价连接，位于结构物终产物两端的救生绳片段携带亲和性修饰，用于在探测表面锚定结构物；所述的探测表面是微球表面、玻璃表面、原子力显微镜探针或基底表面；5）单分子力谱对锚定于两个表面之间的救生绳DNA结构物施加外力，探测待测核酸形成的高级结构，收集包含三维空间位置、力和时间的轨迹数据。

【技术特征摘要】
1.一种基于单分子力谱探测核酸末端结构的方法，其特征在于包括以下步骤：1）待测核酸链的一端携带能进行结合反应的修饰基团，用于锚定在DNA救生绳上；无修饰的另一端为核酸的自由末端，将形成待探测的结构；DNA引物中间位置的修饰基团与待测核酸链进行结合反应，产物是分叉引物；2）分叉引物经分离纯化后用于聚合酶链式反应；3）救生绳DNA片段为不携带待测核酸链的聚合酶链式反应产物；4）救生绳结构物终产物的制备是将携带待测核酸的聚合酶链式反应产物与救生绳DNA片段相间排列，使用连接酶进行共价连接，位于结构物终产物两端的救生绳片段携带亲和性修饰，用于在探测表面锚定结构物；所述的探测表面是微球表面、玻璃表面、原子力显微镜探针或基底表面；5）单分子力谱对锚定于两个表面之间的救生绳DNA结构物施加外力，探测待测核酸形成的高级结构，收集包含三维空间位置、力和时间的轨迹数据。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的结合反...

【专利技术属性】
技术研发人员：于仲波，李宁，王军力，马康康，梁琳，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12