一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法技术

本发明专利技术涉及一种适用于植物ATAC‑seq测序技术的文库构建方法，包括：1)制备植物单细胞悬液；2)Nuclei Extraction Buffer裂解细胞膜，获得细胞核并纯化；所述纯化方法为以下处理：依次经细胞核提纯缓冲液提纯细胞核、经细胞核分离缓冲液进行密度梯度离心分离细胞核；3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测；4)完整细胞核中加入转座酶进行转座反应并纯化；5)PCR扩增，构建二代文库并纯化；6)进行高通量测序，得到基因数据。本发明专利技术的技术方案可去除植物组织中叶绿体、糖类和酚类物质对建库的影响，同时在去除杂质时也保证细胞核的稳定性；该方法基于转座酶对DNA含量敏感的特征，直接通过DNA含量进行定量操作，适用性广，尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差组织进行文库构建。

A Library Construction Method for Plant ATAC-seq Sequencing Technology

The present invention relates to a library construction method suitable for plant ATAC SEQ sequencing technology, including: 1) preparation of plant single cell suspension; 2) decomposition of cell membrane by Nuclei Extraction Buffer to obtain cell nucleus and purify it; the purification method is as follows: purifying cell nucleus by cell nucleus purification buffer in turn, and separating cell nucleus by density gradient centrifugation with cell nucleus separation buffer. (3) collecting nuclei for quantitative and nuclear integrity detection; 4) adding transposase to complete nuclei for transposon reaction and purification; 5) amplifying by PCR to construct second generation library and purification; 6) high-throughput sequencing to obtain gene data. The technical scheme of the invention can remove the influence of chloroplasts, sugars and phenols in plant tissues on Library construction, and ensure the stability of cell nucleus when removing impurities. Based on the sensitive characteristics of transposase to DNA content, the method can directly quantify DNA content, and has wide applicability, especially for the library construction of rare species or tissues and poorly preserved tissues. Jian.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法
本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法。
技术介绍
核小体是真核细胞染色质的基本结构单位，由DNA和组蛋白构成。每个核小体由146bp的DNA缠绕在八聚体的组蛋白上形成，两个核小体之间通过一段连接DNA相连，DNA与组蛋白的结合可以发生动态变化。缠绕在组蛋白上的DNA不易与其它蛋白结合，这些DNA通常处于表达抑制状态。没有核小体结合的开放的DNA区域易于与调控蛋白相结合，则可以使其下游的基因处于活跃表达的状态。细胞通过改变DNA与组蛋白的结合位置，从而调控基因的表达。因此，获得处于开放状态的DNA序列可用于研究基因表达的调控机制，是表观遗传学研究的热点，而ATAC-seq则是用于这类研究的最佳利器。ATAC-seq技术是一种表观遗传学研究技术，通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，获得在该时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。然而，现有技术中绝大多数ATAC-seq实验存在3个方面的问题：1、ATAC-seq实验都是首先通过流式细胞分选技术收集50,000个活细胞或者使用流式细胞核分选筛选50,000个细胞核进行实验，此项技术所需的工作量较大，成本太高，受众很窄，不适用于普通实验室大量进行ATAC-seq实验。2、针对起始量的问题，几乎所有ATAC-seq实验要求的起始量都是50,000个细胞，但是不同生物50,000个细胞所含的DNA数量完全不一样，视该生物的基因组大小而定，且所有的参考文献都是使用DAPI对细胞核进行染色，使用荧光显微镜进行计数。首先荧光显微镜价格很高，很多实验室没有该仪器，再就是DAPI为致癌的试剂，另外使用显微镜计数需要很高的人力，不适合进行大通量的操作。3、植物ATAC-seq相比较于动物或者细胞系，有两大难点，首先是叶绿体的污染，其次是多糖多酚类物质对DNA质量的影响。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了一种适用于植物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法，该方法操作简单，适用性广，尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差植物组织进行文库构建。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备植物单细胞悬液；(2)NucleiExtractionBuffer裂解细胞膜，获得细胞核并纯化；所述纯化方法为以下处理：依次经细胞核提纯缓冲液提纯细胞核、经细胞核分离缓冲液进行密度梯度离心分离细胞核；(3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测；(4)完整细胞核中加入转座酶进行转座反应并纯化；(5)PCR扩增，构建二代文库并纯化；(6)进行高通量测序，得到基因数据。进一步地，所述NucleiExtractionBuffer裂解液包括0.25Msucrose、10mMTris-HCl、1vol％TritonX-100、1×RocheCompleteProteaseInhibitor。进一步地，所述细胞核提纯缓冲液包括20mMMOPS、40mMNaCl、90mMKCl、2mMEDTA、0.5mMEGTA、0.5mMspermidine、0.2mMspermine和1×RocheCompleteProteaseInhibitor，pH＝7.0。进一步地，所述细胞核分离缓冲液包括10mMMES-KOHpH5.4、10mMNaCl、10mMKCl、2.5mMEDTA、250mMsucrose、0.1mMspermine、1mMDTT、1×PVP、0.5mMspermidine、0.5vol％TritonX-100、1×RocheCompleteProteaseInhibitor。进一步地，所述步骤(3)中细胞核定量和细胞核完整性检测的方法为：取RSB重悬细胞核，吹打混匀后，分别取出50ul于两个离心管中，其中一管加入5ul的ProteinaseK，另一管不加ProteinaseK，56℃反应10分钟后检测DNA含量，并通过比较两个离心管中DNA含量来判断细胞核的完整性。更进一步地，步骤(4)中转座反应为：取500ngDNA对应的完整的核小体悬液，立即入转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短暂离心，37℃水浴反应30min；转座结束后用QiagenMinEluteKit进行纯化，10ul洗脱液洗脱，纯化后的DNA于-20度保存。更进一步地，所述转座酶为Tn5转座酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提出的适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法，基于转座酶对DNA含量敏感的特征，直接通过DNA含量进行定量操作，适用性广，尤其适用于物种或组织稀少、保存状态较差组织进行文库构建。本专利技术的方法操作简单，前期处理不需要对细胞精确或者对组织做精确称量，直接使用大体系的裂解液处理，回收到细胞核悬液后，取少量混合液加入ProteinaseK反应10min，细胞核内的核小体解聚，DNA释放，通过Qubit定量变可估算原混合液中核小体含量；此时直接取出大约500ngDNA对应的核小体悬液进行酶转座反应即可满足转座酶通常作用于50ngDNA的要求。该方法尤其适用于物种或组织较为稀少，或者保存状态较差的样本，该方法针对不同物种和不同情况，从100ng-1000ngDNA对应的细胞核作为起始量进行实验，均得到了合理的结果。(2)本专利技术的技术方案中针对植物叶绿体的污染问题，采用TritonX-100裂解，再通过Percoll进行梯度筛选，可以对叶绿体进行有效的去除；通过更换不同pH的缓冲液，同时使用PVP，有效的与糖类和酚类物质结合去除干净，在去除杂质时为了保证细胞核的稳定性，我们在三种缓冲液中分别使用了Tris-HClpH＝8.0、MOPSpH＝7.0、以及MES-KOHpH＝5.4，此三种物质配合精胺和亚精胺，都能起到稳定DNA的效果。(3)本专利技术的方法在细胞核定量和细胞核完整性检测时，增加了一份不加ProteinaseK作为对照，如果核小体完整，不加ProteinaseK处理，核小体和DNA完整的缠绕在一起，此时上清液中无法或者只能检测到少量的DNA。使用ProteinaseK处理后DNA的含量为不使用ProteinaseK处理的10倍以上，则视为核小体完整性良好。(4)现有技术中ATAC-seq技术均使用Illumina的转座酶，而本专利技术通过前期的优化使得回收到的细胞核可以用于国产vazyme公司开发的Tn5转座酶并得到了良好的实验结果，使得ATAC-seq技术不再受转座酶种类的限制。(5)本专利技术针对质量较差的组织样，采取了Percoll密度梯度离心法，根据细胞核悬液不同物质的特性，使用不同密度梯度进行筛选，回收可用的细胞核。这样使得ATAC-seq技术的使用范围更加广泛而不是仅局限于新鲜组织。附图说明图1为缠绕核小体的DNA结构示意图；图2为通过本专利技术的方法获得DNA文库的2100质检图。图3为通过本专利技术的方法测序获得的reads数大小的分布图。图4为通过本专利技术的方法测序获得的peaks的富集情况示意图。具体实施方式展示一下实例来具体说明本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于植物ATAC‑seq测序技术的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备植物单细胞悬液；(2)Nuclei Extraction Buffer裂解细胞膜，获得细胞核并纯化；所述纯化方法为以下处理：依次经细胞核提纯缓冲液提纯细胞核、经细胞核分离缓冲液进行密度梯度离心分离细胞核；(3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测；(4)完整细胞核中加入转座酶进行转座反应并纯化；(5)PCR扩增，构建二代文库并纯化；(6)进行高通量测序，得到基因数据。

【技术特征摘要】
1.一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备植物单细胞悬液；(2)NucleiExtractionBuffer裂解细胞膜，获得细胞核并纯化；所述纯化方法为以下处理：依次经细胞核提纯缓冲液提纯细胞核、经细胞核分离缓冲液进行密度梯度离心分离细胞核；(3)收集细胞核进行定量和细胞核完整性检测；(4)完整细胞核中加入转座酶进行转座反应并纯化；(5)PCR扩增，构建二代文库并纯化；(6)进行高通量测序，得到基因数据。2.根据权利要求1所述的一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法，其特征在于，所述NucleiExtractionBuffer裂解液包括0.25Msucrose、10mMTris-HCl、1vol％TritonX-100、1×RocheCompleteProteaseInhibitor。3.根据权利要求1所述的一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法，其特征在于，所述细胞核提纯缓冲液包括20mMMOPS、40mMNaCl、90mMKCl、2mMEDTA、0.5mMEGTA、0.5mMspermidine、0.2mMspermine和1×RocheCompleteProteaseInhibitor，pH＝7.0。4.根据权利要求1所述的一种适用于植物ATAC-seq测序技术的文库构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：严琰，
申请(专利权)人：嘉兴菲沙基因信息有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33