一种用于PCR扩增的水稻胚芽米DNA模板获得方法及PCR方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种用于PCR扩增的水稻胚芽米DNA模板获得方法及PCR方法，本发明专利技术应用碱处理水稻糙米直接作为PCR反应模板，其目的在于创立一种快速、有效、简便地进行植物DNA扩增的新方法，该方法是将水稻稻米样品去皮，于37℃光照下培养24个小时至露白，得到胚芽米，待用；取S1制得的胚芽米投入试剂A中，于95‑100℃下煮6‑10min，再加入等量的试剂B，搅拌均匀，获得胚芽米DNA模板，利用SSR标准引物，以所述DNA模板进行PCR扩增。本发明专利技术在进行种性验证及辅助田间育种时，具有时效性强、提取步骤简单、化学试剂较少、气味小以及环保的技术效果。

A DNA Template Acquisition Method and a PCR Method for Rice Germ Amplification

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a DNA template acquisition method and a PCR method for rice germ rice used for PCR amplification. The invention applies alkali-treated rice brown rice as a PCR reaction template directly. The purpose of the invention is to create a new method for rapid, effective and simple plant DNA amplification. The method is to peel rice samples and cultivate 24 rice samples under 37 C light. The germ rice obtained from S1 was put into reagent A, boiled at 95 100 C for 6 10 min, then added with reagent B, stirred evenly to obtain germ rice DNA template, and amplified by PCR using SSR standard primers with the said DNA template. The invention has the advantages of strong timeliness, simple extraction steps, less chemical reagents, small odor and environmental protection when carrying out seed verification and assistant field breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种用于PCR扩增的水稻胚芽米DNA模板获得方法及PCR方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于PCR扩增的水稻胚芽米DNA模板获得方法及PCR方法。
技术介绍
自从1980年Batstein等首次描述限制性片段多态性分析(RFLP)作为一种DNA分子标记后，随着分子生物学技术的发展，产生了多种基于PCR的分子标记技术，这些标记技术的第一步即需提取待测样品的基因组DNA。人们经常需要提取高质量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组Sourthern分析、酶切、克隆和测序等分子生物学实验。根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等不同,提取基因组DNA所应用的方法也不同。其中，随着作物分子辅助育种的广泛应用与推广，基因型鉴定是最主要的工作，基因组DNA的提取则是最繁重、最耗时的工作之一。目前以水稻种子为研究材料获取DNA的途径有2种：一种是把种子在恒温箱中发苗后，转换为用叶片的方法提取DNA；另一种是直接用水稻种子提取DNA，需要研磨、离心等繁多的步骤。提取水稻DNA的方法有5种：1)CTAB提取法。此方法多用于禾本科植物基因组DNA的提取，是1987年Doyle最先应用；2)试剂盒提取法。此方法主要应用于提取的DNA高质量；3)SDS提取法。此方法适用于多种植物DNA的提取。4)尿素提取法。此方法适用于一般植物和真核微生物DNA的提取，1990年Dudler最先应用此方法。5)叶片碱煮法。这个方法的对象是水稻，叶片直接碱煮后用作模板。这几种方法的优缺点如下表：除碱煮法以外其他方法均用到研钵、液氮、离心机等，提取步骤繁杂、配制化学试剂种类众多、提取过程刺激味大，操作步骤多。碱煮法虽然很高效、步骤少，但是种子必须要经过5-7天发苗之后才可以开展实验，进行种性验证及辅助田间育种时，检测样品量更多，就显得时效性差。
技术实现思路
本专利技术创造性地应用碱处理水稻糙米直接作为PCR反应模板，其目的在于创立一种快速、有效、简便地进行水稻DNA扩增的新方法。本专利技术的第一个目的是提供一种用于PCR扩增水稻胚芽米DNA模板获得方法，包括如下步骤：S1、材料处理将水稻稻米样品去皮，于37℃光照下培养24个小时至露白，得到胚芽米，待用；S2、试剂准备试剂A：浓度3.5-4.5g/L的NaOH溶液；每500mL的试剂B配方如下：1mol/LpH8.0Tris-HCl5ml，0.5mol/LEDTA1ml，0.5mol/LHCl100ml，加入蒸馏水定容至500ml；S3、胚芽米DNA模板的制备取S1制得的胚芽米投入试剂A中，于95-100℃下煮6-10min，再加入等量的试剂B，搅拌均匀，获得胚芽米DNA模板。本专利技术的第二个目的是提供一种利用上述水稻胚芽米DNA模板进行PCR的方法，利用SSR标准引物，以权利要求1中S3得到的DNA模板进行PCR扩增。优选地，PCR反应体系为：1×PCR缓冲液，2.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTPs，0.2μmol/L正、反向引物，1.0UTaqDNA聚合酶，20ng-40ngDNA模板，总体积10μL；反应程序为，95℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃40s、循环35次，72℃5min，得到扩增产物，12℃保存。与现有技术相比，本专利技术的一种胚芽米直接用于PCR扩增的方法具有如下技术效果：本专利技术用碱处理待测作物种子，直接用作PCR反应DNA模板，在进行种性验证及辅助田间育种时，在检测样品量大的情况下，相比于叶片碱煮法需要在种子发苗后才能开展实验，大大缩短时间，且提取步骤简单、化学试剂较少；根据胚芽米提取DNA和试剂盒提取的DNA扩增效果的结果比较，两者效果完全一致；检测水稻纯度的结果显示，胚芽米碱煮法与叶片碱煮法得出的纯度概率均为94.3％，说明胚芽米直接碱煮提取DNA可用于杂交水稻种子纯度鉴定；同样的，胚芽米碱煮法与叶片碱煮法检测真实度的结果显示，两者的检测结果完全一致，说明胚芽米碱煮法提取的DNA也可用于水稻种品种真实性鉴定。附图说明图1为实施例4胚芽米叶片碱煮法提DNA、对比例1的与试剂盒提DNA的PCR反应扩增结果。图2为对比例2的叶片碱煮法提取的水稻DNA纯度检测结果。图3为实施例4胚芽米碱煮法提取的水稻DNA纯度检测结果。图4为利用对比例2的叶片碱煮法提取水稻DNA的真实性检测结果。图5为利用实施例4的胚芽米碱煮法提取水稻DNA的真实性检测结果。具体实施方式下面结合附图以及具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。实施例1一种用于PCR扩增水稻胚芽米DNA模板获得方法S1、材料处理取50g样品种子用糙米机处理，将胚芽米置于发芽盒中发芽，发芽盒放到37℃的光照培养箱中培养24个小时至露白待用；S2、试剂准备试剂A：浓度4g/L的NaOH溶液；每500mL的试剂B配方如下：1mol/LTris-HCl(PH8.0)5ml，0.5mol/LEDTA1ml，0.5mol/LHCl100ml，加入蒸馏水定容至500ml；S3、胚芽米DNA模板的制备取S1制得的胚芽米投入盛有试剂A的容器中，于100℃下煮8min，取出容器并向容器内加入等量的试剂B，搅拌均匀，获得胚芽米DNA模板。实施例2与实施例1的操作基本相同，区别在于，S2中试剂A：浓度3.5g/L的NaOH溶液；S3中，95℃下煮6min。实施例3与实施例1的操作基本相同，区别在于，S2中试剂A：浓度4.5g/L的NaOH溶液；S3中，97℃下煮8min。经检测，实施例1-3中，实施例1的DNA得出率最高，为100％，确定实施例1为最优方案。实施例4一种利用水稻胚芽米DNA模板进行PCR的方法选用实施例1提取的水稻胚芽米DNA模板，利用SSR标准引物RM7120(SN/T3402-2012，由上海生工合成)，正向引物TGCCCAAAATATATGAAACC，如SEQIDNO.1所示，反向引物TTTTCTTGTTGAATGGGAAC，如SEQIDNO.2所示，反应体系为：1×PCR缓冲液，2.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTPs，0.2μmol/L正、反向引物，1.0UTaqDNA聚合酶，20ng-40ng样品DNA，总体积10μL；反应程序为，95℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃40s、循环35次，72℃5min，得到扩增产物，12℃保存。对比例1试剂盒法提取水稻样品的DNA及PCR扩增S1、取50g样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取70mg-100mg磨碎的样品转入2.0ml的Eppendorf管中；S2、视材料量的多少，加入600ul已预热的BufferA,轻轻混匀后，65℃水浴保温10min:S3、在Eppendorf管管中加入600ul酚/氯仿，上下颠倒充分混匀，抽提2min；S4、12000×g离心5分钟，吸取上清液到一新的Eppendorf管中：S5、加入与上清液等体积的BufferB,混匀，常温放置10min后，12000×g离心5min，去上清，保留沉淀：S6、在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于PCR扩增的水稻胚芽米DNA模板获得方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、材料处理将水稻稻米样品去皮，于37℃光照下培养至露白，得到胚芽米，待用；S2、试剂准备试剂A：浓度3.5‑4.5g/L的NaOH溶液；试剂B，且每500mL的试剂B配方如下：1mol/L pH8.0Tris‑HCl5ml，0.5mol/L EDTA 1ml，0.5mol/L HCl 100ml，加入蒸馏水定容至500ml；S3、胚芽米DNA模板的制备取S1制得的胚芽米投入试剂A中，于95‑100℃下煮6‑10min，再加入等量的试剂B，搅拌均匀，获得胚芽米DNA模板。

【技术特征摘要】
1.一种用于PCR扩增的水稻胚芽米DNA模板获得方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、材料处理将水稻稻米样品去皮，于37℃光照下培养至露白，得到胚芽米，待用；S2、试剂准备试剂A：浓度3.5-4.5g/L的NaOH溶液；试剂B，且每500mL的试剂B配方如下：1mol/LpH8.0Tris-HCl5ml，0.5mol/LEDTA1ml，0.5mol/LHCl100ml，加入蒸馏水定容至500ml；S3、胚芽米DNA模板的制备取S1制得的胚芽米投入试剂A中，于95-100℃下煮6-10min，再加入等量的试剂B，搅拌均匀，获得胚芽米DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪秀峰，倪金龙，许学，马卉，王钰，焦小雨，叶洋洋，鲍翔宇，林玲，左泽平，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34