一种制备PCA3定量检测标准品的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备PCA3定量检测标准品的方法，包括以下步骤：步骤一：对PCA3DNA进行合成；步骤二：PCR扩增；步骤三：PCR产物纯化；步骤四：体外转录得到RNA；步骤五：转录产物纯化；步骤六：RNA标准品定量。通过本发明专利技术制备的PCA3定量检测标准品，可作为阳性质控品，也可以做标准曲线，用实时荧光定量方法对待测品进行基因拷贝数定量，并且灵敏度和特异性均较高。

【技术实现步骤摘要】
一种制备PCA3定量检测标准品的方法
本专利技术涉及一种制备PCA3定量检测标准品的方法。
技术介绍
在我国现阶段，前列腺癌筛查主要内容如下：推荐对于50岁以上，或者是有前列腺癌家族史的45岁以上男性，在充分告知筛查风险的前提下，进行以PSA(PSA检测)检测为基础的前列腺癌筛查，以期早期发现降低死亡率。PSA作为临床上广泛使用的前列腺癌标志物，虽然能够有效诊断部分前列腺癌患者，但良性前列腺增生、前列腺炎以及前列腺按摩、经直肠超声检查等均会导致PSA水平异常升高，且有许多研究表明，当PSA处于灰区即4～10ng/ml时，诊断率仅为25％。所以PSA的肿瘤特异性不高，学者们一直在寻找新的前列腺癌特异性肿瘤标志物。其中长链非编码RNA前列腺癌抗原3(prostatecancerantigen3，PCA3)：PCA3是一种在前列腺癌中表达的因子。已被美国FDA批准作为诊断前列腺癌的标志物。PCA3作为前列腺癌特异性基因，主要表达于前列腺癌细胞中，而在正常组织、良性前列腺增生或其他组织肿瘤中则无表达或者极少表达。在PSA升高的患者中，使用尿液中PCA3作为诊断标志物比使用PSA、血清游离PSA等更能提高前列腺癌的诊断准确率。EAU指南也推荐在初始前列腺穿刺阴性，但仍怀疑前列腺癌的患者中进行PCA3检测。而传统的前列腺穿刺活检虽然灵敏度较高，但特异性较低，易出现不必要的阴性穿刺，故需要寻找一种能够有效诊断前列腺癌的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备PCA3定量检测标准品的方法，该方法制备的PCA3定量检测标准品可用于阳性质控品，也可用于绝对定量测定尿液中PCA3含量。实现本专利技术目的的技术方案是：一种制备PCA3定量检测标准品的方法，包括以下步骤：步骤一：对PCA3DNA进行合成；步骤二：PCR扩增；步骤三：PCR产物纯化；步骤四：体外转录得到RNA；步骤五：转录产物纯化；步骤六：RNA标准品定量。所述步骤二中25ul反应体系为：所述步骤二具体包括以下步骤：S1，将PCR反应所需的成分配置完成后，在PCR仪上于95℃预加热5min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环；S2，扩增循环：在每一个循环中，先于95℃保持10s使模板变性，然后将温度降到55℃保持10s，使引物与模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成DNA,完成一个循环，重复此循环共进行35次，使扩增的DNA片段大量累积；S3，在72℃保持10min，使产物延伸完整，然后12℃环境下保存。所述步骤三的具体步骤为：收集→上柱→洗涤→洗脱。所述步骤四具体为：将T7酶混合液的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用；然后配制反应体系，用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，在PCR仪器中37℃孵育2小时。所述步骤四配制的反应体系为：所述步骤五具体为：首先室温解冻，然后加异丙醇沉淀RNA，然后加无水乙醇清洗3次，再干燥5-10分钟，最后加无菌水溶解。所述步骤六具体为：通过Nanodrop微量分光光度计测定RNA浓度，分装保存在-80℃冰箱备用；然后对该标准品进行10倍梯度稀释，运用实时荧光定量PCR方法，做出标准曲线。采用了上述技术方案，本专利技术具有以下的有益效果：通过本专利技术制备的PCA3定量检测标准品，可作为阳性质控品，也可以做标准曲线，用实时荧光定量方法对待测品进行基因拷贝数定量，并且灵敏度和特异性均较高。具体实施方式(实施例1)本实施例的制备PCA3定量检测标准品的方法，包括以下步骤：步骤一：对PCA3DNA进行合成，合成的序列编码为PCA3-1；步骤二：PCR扩增；定义上下游引物编码分别为PCA3-F和PCA3-R，其25ul反应体系为：PCR扩增程序具体包括以下步骤：S1，将PCR反应所需的成分配置完成后，在PCR仪上于95℃预加热5min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环；S2，扩增循环：在每一个循环中，先于95℃保持10s使模板变性，然后将温度降到55℃保持10s，使引物与模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成DNA,完成一个循环，重复此循环共进行35次，使扩增的DNA片段大量累积；S3，在72℃保持10min，使产物延伸完整，然后12℃环境下保存。步骤三：PCR产物纯化，具体步骤为：收集→上柱→洗涤→洗脱。步骤四：体外转录得到RNA，具体为：将T7酶混合液的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用；然后配制反应体系，用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，在PCR仪器中37℃孵育2小时。前述反应体系为：步骤五：转录产物纯化；具体为：首先室温解冻，然后加异丙醇沉淀RNA，然后加无水乙醇清洗3次，再干燥5-10分钟，最后加无菌水溶解。步骤六：RNA标准品定量；具体为：通过Nanodrop微量分光光度计测定RNA浓度，分装保存在-80℃冰箱备用；然后对该标准品进行10倍梯度稀释，运用实时荧光定量PCR方法，做出标准曲线。通过本实施例的制备PCA3定量检测标准品的方法制备的PCA3定量检测标准品，可作为阳性质控品，也可以做标准曲线，用实时荧光定量方法对待测品进行基因拷贝数定量，并且灵敏度和特异性均较高。以上所述的具体实施例，对本专利技术的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本专利技术的具体实施例而已，并不用于限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备PCA3定量检测标准品的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：合成PCA3DNA；步骤二：PCR扩增；步骤三：PCR产物纯化；步骤四：体外转录得到RNA；步骤五：转录产物纯化；步骤六：RNA标准品定量。

【技术特征摘要】
1.一种制备PCA3定量检测标准品的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：合成PCA3DNA；步骤二：PCR扩增；步骤三：PCR产物纯化；步骤四：体外转录得到RNA；步骤五：转录产物纯化；步骤六：RNA标准品定量。2.根据权利要求1所述的一种制备PCA3定量检测标准品的方法，其特征在于：所述步骤二中25ul反应体系为：3.根据权利要求2所述的一种制备PCA3定量检测标准品的方法，其特征在于：所述步骤二具体包括以下步骤：S1，将PCR反应所需的成分配置完成后，在PCR仪上于95℃预加热5min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环；S2，扩增循环：在每一个循环中，先于95℃保持10s使模板变性，然后将温度降到55℃保持10s，使引物与模板充分退火，最后在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成DNA,完成一个循环，重复此循环共进行35次，使扩增的DNA片段大量累积；S3，在72℃保持10min，使产物延伸完整，然后12℃环境下保存。4.根据权利要求1所述的一种制...

【专利技术属性】
技术研发人员：林忠旺，赵培雅，
申请(专利权)人：杭州昱鼎生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33