本发明专利技术涉及一种试剂盒及应用，尤其涉及一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。首次发现通过冻融尿液，可以析出大量的尿液结晶等杂质，通过低速离心去除，提高了后续外泌体提取的纯度。本发明专利技术通过流通液采点BCA检测蛋白浓度，成功避开空柱体积，以及在外泌体后流通下来的杂蛋白区域，进一步提高了提取的外泌体纯度。进一步提高了提取的外泌体纯度。进一步提高了提取的外泌体纯度。
【技术实现步骤摘要】
一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用
[0001]本专利技术涉及一种试剂盒及应用，尤其涉及一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。
技术介绍
[0002]外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约30
‑
150nm。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。外泌体内容物：1)核酸：rRNA、miRNA、cirRNA、lncRNA、mRNA等。2)蛋白质：如微管蛋白、肌动蛋白、热休克蛋白、膜蛋白如：四跨膜蛋白(CD9，CD63，CD81，CD82)、整合素、膜联蛋白等。3)脂质：神经鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺等。
[0003]PEG沉淀法或SEC柱法也广泛应用到外泌体提取领域。PEG沉淀法的原理为：通过聚合物劫持水分子，使得外泌体溶解度降低，进而在低速离心条件下发生沉降。如专利“一种基于沉淀试剂法的细胞上清液外泌体提取工艺”中应用到PEG6000和PEG4000沉降细胞上清液中的外泌体。专利“一种分离尿液中外泌体的方法”中使用的是商业化外泌体沉淀试剂。专利“一种从尿液中提取外泌体的方法及试剂”中也是使用PEG沉淀法提取外泌体。但是PEG沉淀法弊端是一些杂蛋白表面也有水分子，也会沉降下来，影响了外泌体纯度。此方法可以处理大量样本，但是杂蛋白多，纯度低。SEC柱法即排阻色谱法，其原理为：多孔聚合物微球的柱子。分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，不容易改变囊泡的结构。SEC柱法是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。如专利“一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法”中提到用丙烯葡聚糖凝胶分离柱来准确洗脱收集外泌体，外泌体样品为细胞培养上清或血液。SEC柱法只适合少量样品处理，如从几毫升血液中提取有限的外泌体，并不适合大量样本的处理，如从大量尿液样品中直接提取外泌体就不适用。而且SEC柱法处理的样品量越大，需要的柱填料越多，耗时越长，回收外泌体的浓度低，提取效果不理想。专利“基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法”是一种超滤和SEC柱法结合的方法，但此法用SEC柱法结合超滤法浓缩处理又大大提高了材料成本，而且收超滤管限制只能处理少量尿液样本。
技术实现思路
[0004]本专利技术主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种解决了上述外泌体提取方法的弊端，实现了尿液外泌体提取样本处理量大，提取量多，操作简单，低成本，纯度高的一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。
[0005]本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
[0006]一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，按如下步
骤进行实施：
[0007](1)、最佳选择新鲜晨尿，在2～8℃，150～500
×
g离心5～15min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；
[0008](2)、将(1)中获得的尿液上清液，在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；
[0009](3)、将(2)中获得的尿液上清液，置于﹣20～
‑
80℃冰箱中冷冻30min或以上，2～8℃或常温解冻后，重复(2)中离心步骤，在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；
[0010](4)、将(3)中获得的尿液上清液，转移到新的离心管；底部沉淀用DTT或TCEP处理，37℃摇床震荡孵育10～30min；
[0011](5)、将(3)中获得的尿液上清液，倒入(4)中沉淀处理后的离心管，加入适量PEG溶解并混匀，使得终浓度为5％～20％；
[0012](6)、将(5)中含5％～20％PEG的尿液，于4℃冰箱，静置过夜；在2～8℃，5000～10000
×
g离心30min～1h，弃尿液上清液，倒扣于吸水纸上5～10min；
[0013](7)、用移液枪吸取0.5～1ml的PBS溶液，反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，收集悬浮沉淀；此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；
[0014](8)、将(7)中收集的悬浮沉淀置于低速离心机150～500
×
g旋转30s～1min，弃残留的PEG颗粒；收集上清，得到悬浮沉淀可置于
‑
80摄氏度保存；
[0015](9)、SEC柱，经3倍柱体积PBS溶液润洗平衡，此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；底盖出口无液体流出后，封住底盖出口，准备好1.5～2ml离心管，按顺序写好编码；加入悬浮沉淀，打开底盖，按离心管编码顺序接取SEC柱流通液；待底盖出口无液体流出，再加洗脱液PBS溶液，此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；继续接取SEC柱流通液；除去空柱体积约1.5ml，收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1～2ml洗脱液；收集的外泌体于
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80摄氏度保存。
[0016]作为优选，所述的步骤(4)中的DTT或TCEP工作浓度为100～200mg/ml，每管沉淀使用量为50～500ul。
[0017]作为优选，所述的步骤(5)中的PEG选用PEG4000或PEG6000中的一种。
[0018]作为优选，所述的步骤(5)中的PEG溶解于处理后的尿液上清液，并使其混合液终浓度为5％～20％(g/v)。
[0019]作为优选，所述的步骤(7)中反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，动作需轻柔，旋转离心管，让PBS沿着管壁将外泌体洗脱下来。
[0020]作为优选，所述的步骤(9)中SEC柱为琼脂糖凝胶柱。
[0021]作为优选，所述的步骤(9)中琼脂糖凝胶柱型号分别包括2B、2B
‑
L、4B、4B
‑
L。
[0022]作为优选，所述的步骤(9)中SEC柱，柱体积为5～10ml。
[0023]作为优选，所述的步骤(9)中收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1～2ml洗脱液。但若想得到更高浓度的外泌体，优选为收集1～1.5ml洗脱液。
[0024]创新点：
[0025]①
通过两步差速离心，在2～8℃，150～500
×
g离心5～15min，去除尿液中的杂质和活细胞。在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，去除尿液中的死细胞和残骸。此步骤在去除尿液死细胞和残骸前，先通过更低速的离心步骤，将活细胞和一些杂质先去除，这种方
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，其特征在于按如下步骤进行实施：(1)、最佳选择新鲜晨尿，在2～8℃，150～500
×
g离心5～15min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；(2)、将(1)中获得的尿液上清液，在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；(3)、将(2)中获得的尿液上清液，置于﹣20～
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80℃冰箱中冷冻30min或以上，2～8℃或常温解冻后，重复(2)中离心步骤，在2～8℃，1000～2000
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g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；(4)、将(3)中获得的尿液上清液，转移到新的离心管；底部沉淀用DTT或TCEP处理，37℃摇床震荡孵育10～30min；(5)、将(3)中获得的尿液上清液，倒入(4)中沉淀处理后的离心管，加入适量PEG溶解并混匀，使得终浓度为5％～20％；(6)、将(5)中含5％～20％PEG的尿液，于4℃冰箱，静置过夜；在2～8℃，5000～10000
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g离心30min～1h，弃尿液上清液，倒扣于吸水纸上5～10min；(7)、用移液枪吸取0.5～1ml的PBS溶液，反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，收集悬浮沉淀；此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；(8)、将(7)中收集的悬浮沉淀置于低速离心机150～500
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g旋转30s～1min，弃残留的PEG颗粒；收集上清，得到悬浮沉淀可置于
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80摄氏度保存；(9)、SEC柱，经3倍柱体积PBS溶液润洗平衡，此处PBS溶液的pH值为7.2～7.4；底盖出口无液体流出后，封住底盖出口，准备好1.5～2ml离心管，按顺序写好编码；加入悬浮沉淀，打开底盖，按离心管编码顺序接取SEC柱流通液；待底盖出口无液体流出，再加洗脱液PBS溶液，此处...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁颖，孔繁平，
申请(专利权)人：杭州昱鼎生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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