一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，包括血浆样品预处理和试样测定：以K2EDTA为抗凝剂，以西格列汀

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法


[0001]本专利技术属于医药
，更具体的说涉及一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法。

技术介绍

[0002]西格列汀(Sitagliptin,SGT)是一种二肽基肽酶4(DPP
‑
4)抑制剂，在2型糖尿病患者中可通过增加活性肠促胰岛激素的水平而改善血糖控制。肠促胰岛激素包括胰高糖素样多肽
‑
1(GLP
‑
1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)，由肠道全天释放，并且在进餐后水平升高。西格列汀能够防止DPP
‑
4水解肠促胰岛激素，从而增加活性形式的GLP
‑
1和GIP的血浆浓度。通过增加活性肠促胰岛激素水平，西格列汀能够以葡萄糖依赖的方式增加胰岛素释放并降低胰高糖素水平。对于存在高血糖症的2型糖尿病患者，胰岛素和胰高糖素水平发生的上述变化可降低糖化血红蛋白A1c(HbA1c)并降低空腹血糖和餐血糖水平。
[0003]目前现有技术检测人血浆中的西格列汀的分析方法参差不齐，多采用非同位素内标，无法保证待测物与内标洗脱方式的一致性。为满足临床生物样品分析的需求，需开发更简单、可靠、省时的人血浆中西格列汀浓度测定的方法，本专利建立了检测血浆西格列汀浓度的高效液相质谱法，专属性高、操作简单、成本低廉，特别适合大批量样品的自动化检测工作。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，以西格列汀
‑
d4为内标，加入沉淀剂进行蛋白沉淀，取上清液加稀释剂，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，检测速度快，精度高，灵敏度好。
[0005]本专利技术技术方案一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006](1)血浆样品预处理：
[0007]以K2EDTA为抗凝剂，以西格列汀
‑
d4为内标；在96孔板的孔中加入50μL样品，加入50μL浓度为100.000ng/mL的内标西格列汀
‑
d4工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μL甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μL至另一96孔收集板中，加入300μL 50％甲醇，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得测试样品；
[0008](2)试样测定：
[0009]取1μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀
‑
d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的西格列汀浓度；
[0010]液相色谱条件为：
[0011]色谱柱：Welch Ultimate XB
‑
C
18
，柱规格为2.1
×
100mm，5μm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：甲醇；强洗液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；柱塞清洗液：水/甲醇体积百分比为90/10；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，
流速为0.5mL/min，进样量为1μL，分析时间4min；西格列汀和西格列汀
‑
d4预期保留时间约在1.55min；
[0012]质谱条件为：
[0013]离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为325℃，蒸汽温度为350℃，驻留时间为200ms。西格列汀和西格列汀
‑
d4的碰撞电压分别为18V、19V，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。
[0014]优选地，梯度洗脱程序为：
[0015][0016]优选地，步骤(2)中，采用内标法，以西格列汀和内标西格列汀
‑
d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。
[0017]优选地，标准曲线方程的建立包括以下步骤：
[0018]取190μL空白血浆置于聚丙烯管中，以工作液的形式分别添加10μL浓度分别为40.00、80.000、200.000、1000.000、4000.000、8000.000、16000.000、20000.000ng/mL的西格列汀工作溶液，混匀后分别取50μL标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本加入50μL的100.000ng/mL的内标西格列汀
‑
d4溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μL甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μL至另一96孔收集板中，加入300μL 50％甲醇，封板，混匀10min；样品在4℃，2623g离心10min，得标准样品，待进样；
[0019]分别取1μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀
‑
d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于回算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。
[0020]优选地：质量控制的建立包括以下步骤：
[0021]配制西格列汀浓度为40.000、120.000、1200.000、6000.000、15000.000μg/mL的质控样品工作液。取380μL空白血浆置于聚丙烯管中，分别添加质控工作液20μL混匀后分别取质控样品50μL加入50μL的100.000ng/mL的内标西格列汀
‑
d4溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μL甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μL至另一96孔收集板中，加入300μL 50％甲醇，封板，混匀10min；样品在4℃，2623g离心10min，获得质控标准样品；
[0022]分别取1μL标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测质控样品中的西格列汀和内标西格列汀
‑
d4的色谱峰，并根据标准曲线回算出质控样品测定浓度。
[0023]本专利技术技术方案的一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法的有益效果是：
[0024]1、使用同位素内标，保证待测物与内标洗脱的一致性；
[0025]2、预处理方法较简便，适用于高通量测定；
[0026]3、专属性强：在本实验所用的色谱条件下，西格列汀保留时间为1.55min左右，内标西格列汀
‑
d4保留时间在1.55min左右。西格列汀和内标西格列汀
‑
d4的峰形良好，无杂峰明显干扰测定，基线平稳；
[0027]4、本专利技术方法快速、准确、特异性强为西格列汀的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为2.000～1000.000ng/mL。
附图说明
[0028]图1为人血浆中西格列汀的LC
‑
MS/MS检测方法中西格列汀的产物离子扫描质谱图；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：以K2EDTA为抗凝剂，以西格列汀
‑
d4为内标；在96孔板的孔中加入50μL样品，加入50μL浓度为100.000ng/mL的内标西格列汀
‑
d4工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μL甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μL至另一96孔收集板中，加入300μL 50％甲醇，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得测试样品，待进样；(2)试样测定：取1μL测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀
‑
d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的西格列汀浓度；液相色谱条件为：色谱柱：Welch Ultimate XB
‑
C
18
，柱规格为2.1
×
100mm，5μm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：甲醇；强洗液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；柱塞清洗液：水/甲醇体积百分比为90/10；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为1μL，分析时间4min；西格列汀和西格列汀
‑
d4预期保留时间约在1.55min；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为325℃，蒸汽温度为350℃，驻留时间为200ms。西格列汀和西格列汀
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d4的碰撞电压分别为18V、19V，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。2.根据权利要求1所述的液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：3.根据权利要求1所述的液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用内标法，以西格列汀和内标西格列汀
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d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。4.根据权利要求1所述的液质联用测定血浆中西格...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾虹，许杨，孙珍珍，唐丹丹，
申请(专利权)人：安徽万邦医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：