一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种制备前列腺癌标志物，尤其涉及一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1‑F，GSTP1‑R,及荧光水解探针GSTP1‑P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1‑F，GSTP1‑R,及荧光水解探针GSTP1‑P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1‑F，RASSF1‑R,及荧光水解探针RASSF1‑P；检测ACTB基因的引物ACTB‑F，ACTB‑R,及荧光水解探针ACTB‑P。取样方便、检测快速、准确率高，可以实现前列腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂盒，以及提供GSTP1，APC和RASSF1联合使用作为前列腺癌分子标记物的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒
本专利技术涉及一种制备前列腺癌标志物，尤其涉及一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。
技术介绍
前列腺癌(ProstateCancer，PCa)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，占全球肿瘤发病率第二位、死亡率第六位。我国PCa的发病率平均每年增长4.7％，是增加最快的男性恶性肿瘤。上海市疾病控制中心的资料显示，前列腺癌的发病率自2002年起已跃居男性泌尿生殖系恶性肿瘤的首位。前列腺癌的诊断在世界范围内还存在重大挑战：在美国，Gilbert对36316例前列腺穿刺病例进行统计发现，穿刺阳性率仅为31％，在中国，一项1244例穿刺病理的统计结果显示，中国人群的穿刺阳性率仅为32％。根据中国前列腺癌联盟公布的全国33家三甲医院年穿刺量的数据进行估算，全国范围内仅三甲医院每年有35万例穿刺，而其中约有25万例患者穿刺结果为阴性，在这25万人中又约有1/3的患者，经二次穿刺、甚至多次穿刺最终确诊为前列腺癌。首次穿刺活检阴性的患者如何处理常常困扰泌尿外科医师，一方面，由于现行的诊断指标的特异性较差，比如PSA，导致大量非前列腺癌患者接受了非必要的穿刺；另一方面，由于前列腺肿瘤具有多中心发生的特点，而前列腺穿刺活检获得的标本量较少，取到组织体积不足腺体1％，导致了漏诊的可能性较大。在何种情况下进行再穿刺，在何种情况下无需再次穿刺仍然很难界定。目前临床上亟需安全、有效的检测手段来解决如下问题：在首次穿刺阴性的病人中，有效排除非前列腺癌患者，同时筛选出由于首次穿刺取样差异造成的假阴性患者，进一步提升前列腺癌的诊疗效率。与正常细胞相比，癌细胞特定基因区域的高甲基化现象已得到了充分研究与证实，而近几年研究表明，癌细胞/组织可诱导周边细胞/组织特定位点基因启动子区甲基化，这些前期的表观遗传改变，不能通过组织学辨别，但是可以通过甲基化检测识别出来,该现象被称为“Fieldeffect”。通过MS-PCR可检测相关基因启动子区甲基化修饰。
技术实现思路
本专利技术主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种取样方便、检测快速、准确率高，可以实现前列腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂盒，以及提供GSTP1，APC和RASSF1联合使用作为前列腺癌分子标记物的应用的一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1-F，RASSF1-R,及荧光水解探针RASSF1-P；检测ACTB基因的引物ACTB-F，ACTB-R,及荧光水解探针ACTB-P。试剂盒的制备方法，按以下步骤进行：通过前列腺癌细胞系LNCaP的细胞DNA提取物的亚硫酸盐转化，使未甲基化区域的所有胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而CpG岛屿区域的胞嘧啶仍保持胞嘧啶不变，通过荧光PCR的方法检测靶区域的甲基化状态，以未含甲基化修饰序列的ACTB基因作为内参，可检测系列梯度稀释的LNCaP中GSTP1,APC,RASSF1三个基因的标准甲基化水平，该检测方法具有良好的线性关系。试剂盒的应用方法，按以下步骤进行：在FFPE样本中甲基化位点的检测靶标，靶标包括GSTP1，APC、RASSF1、ACTB，及联合以上靶标检测前列腺癌的诊断试剂盒；其组分包括：引物探针混合试剂、PCR试剂、阳性质控品、阴性质控品；该方法灵敏度高、特异性好，仅需收集首次穿刺剩余FFPE样本，经过DNA提取，亚硫酸盐转化，PCR上机三个步骤，即可在同管样本中完成四个靶点的检测，根据检测结果，代入回归公式，即可得出前列腺癌风险系数，当风险系数p大于0.56时，表明受检者患前列腺癌风险较高，需进行二次穿刺以对前列腺癌进行确诊；当检测的风险系数p小于0.56时，表明受检者患前列腺癌风险较低，可进行定期的PSA检查或其他常规诊断方法监测即可。本专利技术的目的之一在于提供GSTP1，APC和RASSF1在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的三种靶标联合应用，通过GSTP1，APC和RASSF1联合检测，并建立回归模型，作为前列腺癌诊断指标，提高诊断和预示前列腺癌的检测性能；本专利技术的目的之二在于提供FFPE样本中GSTP1，APC和RASSF1甲基化水平的联合检测试剂盒应用于前列腺癌的诊断，该试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，该基因用于控制每个样本的质量，同时可以对靶点的甲基化水平进行标准化，以避免取样差异对检测结果的影响。该试剂盒使用多重qRT-PCR技术，在单管中完成四个基因的检测。此外还制定了阳性质控品及阴性质控品，以控制试剂盒整个检测过程。阳性质控品为LNCaP细胞甲基化后的纯化产物，阴性质控品为超纯水。本专利技术的目的是提供一种基于FFPE样本中GSTP1，APC和RASSF1甲基化水平在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的联合应用，该方法使用Taqman荧光RT-PCR法，在单管中实现对GSTP1，APC、RASSF1及内参ACTB的检测，通过回归拟合，获得前列腺癌发生概率的计算公式。附图说明图1GSTP1基因甲基化测序结果；图2APC基因甲基化测序结果；图3RASSF1基因甲基化测序结果；图4甲基化基因检测标准曲线绘制；图5块状FFPE样本标准化甲基化水平检测结果；图6前列腺穿刺FFPE切片样本标准化甲基化水平检测结果；图7前列腺穿刺FFPE切片样本甲基化模型检测结果。具体实施方式下面通过实施例，并结合附图，对本专利技术的技术方案作进一步具体的说明。实施例1：如图所示，实施例1，用于前列腺癌诊断的甲基化位点，包括表1所列核酸序列中由[CG]指示的甲基化位点的以及与表1中的由[CG]指示的核酸在序列上完全互补的核酸甲基化位点。表1DNA甲基化标志物的组成实施例2：引物探针序列：本专利技术提供一种基于FFPE样本的四个基因检测前列腺癌的联合应用，该应用针对四个基因启动子区CpG岛上的甲基化位点进行设计，本试剂盒的引物对组合在引物序列设计上克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，每个基因通过F引物及R引物对样本中高甲基化区域序列进行扩增，通过水解探针P对扩增结果进行实时荧光显示，以区分相应基因位点是否存在高甲基化现象。所述F引物、R引物、P探针的序列如下：GSTP1-F,以下序列任意一种：SEQIDNO.4-10...

【技术保护点】
1.一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，其特征在于：试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1-F，RASSF1-R,及荧光水解探针RASSF1-P；检测ACTB基因的引物ACTB-F，ACTB-R,及荧光水解探针ACTB-P。/n

【技术特征摘要】
1.一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，其特征在于：试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1-F，RASSF1-R,及荧光水解探针RASSF1-P；检测ACTB基因的引物ACTB-F，ACTB-R,及荧光水解探针ACTB-P。


2.基于权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
通过前列腺癌细胞系LNCaP的细胞DNA提取物的亚硫酸盐转化，使未甲基化区域的所有胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而CpG岛屿区域的胞嘧啶仍保持胞嘧啶不变，通过荧光PCR的方法检测靶区域的甲基化状态，以未含甲基化修饰序列的A...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔繁平，常俊楠，孟慧佳，
申请(专利权)人：杭州昱鼎生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33