一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。本发明专利技术所提供的试剂盒具有灵敏度高，检测速度快，操作简单，耗费低等优点。

Kit for detecting rs4244285 genotype of CYP2C19 gene SNP locus and preparation method thereof

Kit and a preparation method thereof. The invention discloses a method for detecting CYP2C19 gene SNP site rs4244285 genotype, the kit includes: standard, primer, containing fluorescent dye qPCR amplification reagent; the standard to include CYP2C19 rs4244285 (c.681G> A) of wild type DNA and CYP2C19 rs4244285 sequence contains (c.681G> A) locus homozygous mutant DNA sequence; the primers used for amplification and test sample standard. The kit provided by the invention has the advantages of high sensitivity, fast detection speed, simple operation and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
目前已证实CYP2C19不但参与抗癫痫药物的代谢，而且很多的临床重要药物都是它的底物。人类对药物的氧化代谢能力可分为2种表型，一种为强代谢型，另一种为弱代谢型，后者主要是由于CYP2C19*2和CYP2C19*3这两个缺陷型等位基因引起的。由于不同个体存在药物代谢方面的差异，因而给药后可能会出现严重的不良反应或药物剂量不足，从而导致治疗的失败。CYP2C19在体内可催化一系列药物，如S-美芬妥英(S-mephenytoin，S-MP)、奥美拉唑(omeprazole，OPZ)、地西汁(diazepam，DZ)、去甲地西汁(demethyldiazepam)、丙米嗪(imipramine，IMI)、甲苯磺丁脲(tolbutamide，D860)、苯巴比妥(phenobarbital，PB),氯胍(proguanil)和二氯胍(chlorproguanil)等。CYP2C19*2(rs4244285)是第五外显子第681位的碱基发生变异(G-A)，形成了一个异常的位点，使得转录时在第五外显子的初始段丢失了一个包含SmaI限制性内切酶位点的40碱基对(634-682bp)的片段，从而改变了mRNA的阅读框架，在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生一个终止密码，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质缺失血红素结合区，从而丧失了催化活性。高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting,HRM)的分析原理是在常规聚合酶链式反应(PCR)过程中饱和荧光染枓与双链DNA结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上便可判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。所以，HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒。本专利技术的第二个目的是为了提供一种上述试剂盒的制备方法。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。优选地，所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。优选地，所述标准品为连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。优选地，所述引物为CYP2C19-F和CYP2C19-R。优选地，所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。本专利技术还提供所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)引物设计与合成根据CYP2C19rs4244285基因序列，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计一组引物；2)制备标准品A、合成含有CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列；B、将野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列分别与质粒连接；将连接后的质粒导入细菌中；培养细菌并且获得阳性克隆；C、扩大培养步骤B所获得的阳性克隆，提取质粒得到标准品；3)选购或配制含有荧光染料的qPCR扩增试剂。优选地，步骤B中所述的质粒为pMD18-T质粒。优选地，所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。优选地，步骤B中将序列W或序列M分别与pMD18-T质粒连接，所采用的连接体系为：SolutionI为来自TaKaRa公司，编号D6020A的产品。连接的反应时间为10-16小时，反应温度为16℃。优选地，步骤C的具体操作为将阳性克隆接种于含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；再从菌体中提取质粒获得标准品。本专利技术所述序列W为：TTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAAT；其中标有下划线的碱基为基因突变位点；本专利技术所述序列M为：TTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAAT；其中标有下划线的碱基为基因突变位点。本专利技术所述的CYP2C19-F和CYP2C19-R的序列具体为：CYP2C19-F：5'-TGCAATAATTTTCCCACTATCATT-3'CYP2C19-R：5'-TGGTGTTCTTTTACTTTCTCCA-3'相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术制备了一种试剂盒，使HRM方法用于鉴定CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型，该试剂盒具有灵敏度高、成本低、操作简单、鉴定速度快的优点。本专利技术还提供该试剂盒的制备方法，通过控制制备过程的参数使本专利技术的试剂盒灵敏度更高。附图说明图1、本专利技术试剂盒的灵敏度测试结果图图2、本专利技术对基因型的检测结果图图3、Sanger测序结果图具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：实施例1：一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为连接有序列W的pMD18-T质粒和连接有序列M的pMD18-T质粒。所述引物为CYP2C19-F和CYP2C19-R。所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。实施例2重组野生型和纯合突变型质粒pMD18-T-rs4244285的构建和转化1、合成序列W和序列M。2、连接反应：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒：其特征在于包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19 rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。

【技术特征摘要】
1.一种检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒：其特征在于包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的野生型DNA序列和包含CYP2C19rs4244285(c.681G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。2.根据权利要求1所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。3.根据权利要求2所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述标准品为连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。4.根据权利要求2所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述引物为CYP2C19-F和CYP2C19-R。5.根据权利要求1所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒，其特征在于：所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。6.一种如权利要求1所述的检测CYP2C19基因SNP位点rs4244285基因型的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)引物设计与合成根据CYP2C19rs4244285基因序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，同重湘，尤崇革，谢小冬，李琳，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32