基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。研究表明，ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性均与唑类抗真菌药物的耐药性相关，基于核酸质谱检测技术对这些基因的突变位点进行单核苷酸多态性分析能够判断患者所感染的白假丝酵母菌是否对唑类抗真菌药物具有耐药性，有助于临床上及时调整白假丝酵母菌感染患者用药。药。

【技术实现步骤摘要】
基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，属于分子生物学


技术介绍

[0002]白色假丝酵母又称白色念珠菌(Canidiaalbicans)，属于真菌界半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科。白色假丝酵母通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则白色假丝酵母大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。
[0003]念珠菌病主要是白假丝酵母菌引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病，常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。目前，主要通过使用抗真菌药物治疗念珠菌病，而白假丝酵母菌耐药性的产生是导致念珠菌病临床治疗失败的重要原因之一。对患者所感染的白假丝酵母菌进行耐药性检测，以及时更换适用的抗真菌药物，对念珠菌病的治疗十分重要。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。
[0005]在本专利技术的一种实施方式中，所述ERG11基因突变位点包括T315C、A428G、A685G、T996C、G1020A、G1349A、C1470T和/或G1609A；所述ERG3基因突变位点包括A100C、T134G、C662T、T836C和/或C1052T；所述TAC1基因基因突变位点包括A673G、A2929G和/或G2939A；所述UPC2基因突变位点包括G1947A；所述MRR1基因突变位点包括G2751A；所述MRR2基因突变位点包括C1049A。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。
[0008]本专利技术还提供了检测上述分子标志物的试剂在制备检测白假丝酵母菌耐药性的产品中的应用。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的特异性延伸引物。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂还包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因的扩增引物组。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂还包括PCR扩增所需试剂以及核酸质谱鉴
定所需试剂。
[0014]本专利技术还提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测上述分子标志物的试剂。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。
[0017]核酸质谱系统的工作原理为：MALDI应用激光照射核酸分子与基质形成的共结晶薄膜，基质吸收激光能量并传递给核酸分子，从而使基质和核酸分子间发生质子转移，产生完整的电离化核酸分子。TOF使离子化的核酸分子在电场作用下加速飞过真空管腔，根据样品分子的电荷及分子量不同以及到达检测接收器的时间差异，智能分析SNP的基因型。
[0018]核酸质谱系统的检测流程如下：
[0019]样品的准备：准备核酸质谱仪可直接检测的稀有样本和降解样品，以及可兼容全血、唾液、口腔黏膜、干血斑、活检组织、石蜡包埋组织、血浆等各类样本；
[0020]扩增和延伸反应的引物设计：由于核酸质谱仪的SNP分型是一种在PCR基础上进行单碱基延伸的技术，因此相关的引物设计必须遵循PCR引物设计原则。引物应尽量避免自身形成发卡结构及5个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的连续序列；由于同一体系可进行多达几十重反应，引物间需避免互补，防止出现非特异性扩增延伸而干扰检测结果；
[0021]PCR扩增、纯化及单碱基延伸反应：在核酸扩增阶段，通过多重PCR扩增多达含40个待检SNP的目标片段；PCR结束后加入虾碱性磷酸酶进行纯化，去除反应液中的脱氧核苷酸；随后在反应液中加入针对SNP位点的特异性单碱基延伸引物及经修饰的双脱氧核苷酸进行单碱基延伸反应，使等位基因的延伸产物仅表现为末端一个碱基的差异；
[0022]核酸质谱仪的分型检测：将完成延伸的反应液与树脂混合进行离子交换，去除吸附于DNA片段上的离子，再经脱盐后将反应液点在靶板基质上形成共结晶；基质可增强核酸分子对激光的吸收，保护核酸分子的稳定性；核酸质谱仪根据不同质量的单碱基的飞行时间差异自动分析确定对应的碱基类型。整个检测流程和数据分析简单，检测周期短；另外，由于核酸质谱技术采用物理方法学，检测过程只需简单的PCR及延伸试剂，无需荧光探针和荧光类试剂，因此试剂成本低。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的特异性延伸引物。
[0024][0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂还包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因的扩增引物组。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂还包括PCR扩增所需试剂以及核酸质谱鉴定所需试剂。
[0027]本专利技术技术方案，具有如下优点：
[0028]本专利技术提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的高密度、高保守的DNA序列多态性。研究表明，ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性均与唑类抗真
菌药物的耐药性相关，对这些基因的突变位点进行单核苷酸多态性分析能够判断患者所感染的白假丝酵母菌是否对唑类抗真菌药物具有耐药性，有助于临床上及时调整白假丝酵母菌感染患者用药。
[0029]SNP的常见检测方法包括直接测序法、基因芯片法、PCR
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限制性片段长度多态性法、荧光标记的单碱基延伸法和核酸质谱法等。其中核酸质谱法是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix
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assistedlaserdesorption/ionization本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。2.如权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述ERG11基因突变位点包括T315C、A428G、A685G、T996C、G1020A、G1349A、C1470T和/或G1609A；所述ERG3基因突变位点包括A100C、T134G、C662T、T836C和/或C1052T；所述TAC1基因基因突变位点包括A673G、A2929G和/或G2939A；所述UPC2基因突变位点包括G1947A；所述MRR1基因突变位点包括G2751A；所述MRR2基因突变位点包括C1049A。3.如权利要求1或2所述的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。4.如权利要求3所述的分子标志...

【专利技术属性】
技术研发人员：车妍，高恺，张晓慧，乔世刚，仇俊兰，安建中，奉林，王小虎，魏虎来，沈荣，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：