一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系制造技术

本发明专利技术提供了一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系及检测方法。具体地，本发明专利技术提供了一种比例优化的LAMP扩增显色剂，以及包含所述显色剂的反应体系和试剂盒，本发明专利技术还提供了一种利用所述显色剂的LAMP检测方法。实验表明通过调整显色剂中钙黄绿素和Mn

A detection of schistosome infection from the nail nucleic acid reaction system

The present invention provides a system for the detection of nucleic acid reaction from the nail schistosome infection and detection methods. Specifically, the invention provides an optimized proportion of LAMP amplification of chromogenic agent and a chromogenic reagent reaction system and kit, the invention also provides a chromogenic agent using the LAMP detection method. Experiments showed that calcein and Mn were regulated by adjusting the chromogenic agents

【技术实现步骤摘要】
一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系
本专利技术涉及检测领域，具体地，涉及一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系。
技术介绍
血吸虫病一直是一种严重危害人民身体健康和阻碍我国和全球许多国家社会经济发展的重要寄生虫病。经过多年持续努力，全国血吸虫病疫情得到了有效遏制。当前全国血吸虫病呈现低度流行态势，但传播媒介(钉螺)及渔船民等仍然较多，血吸虫病传播风险依然存在，2013年以来在血吸虫病传播阻断地区相继发现了血吸虫感染阳性钉螺，以及江西省、湖南省等地发生数例急性血吸虫病感染案例，加强血吸虫病传播风险监测应对显得十分迫切。然而现有的实验方法不能满足低感染态势下的预警监测，如钉螺压碎法结合镜检在低感染情况下容易漏检；哨鼠感染法实验监测疫水环境耗时长，需35天以上，检测滞后，不能预警。发展敏感、实用的感染性钉螺检测试剂显得非常必要和重要。近年来，基于PCR技术的分子生物学方法如经典PCR、real-timePCR方法等在钉螺感染血吸虫检测中表现了其敏感性高、特异性强的优点，但由于这些方法需要昂贵的试验设备、操作比较繁琐，未能在血吸虫病防治现场大规模推广。因此，本领域迫切需要开发方便快捷、灵敏度高的钉螺体内感染血吸虫的检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的检测钉螺体内感染血吸虫的反应体系及检测方法。本专利技术的第一方面，提供了一种LAMP扩增显色剂，所述的显色剂包含(a)钙黄绿素(Calcein)、(b)Mn2+、和(c)任选的相溶溶剂；并且所述钙黄绿素和Mn2+的摩尔浓度比为1:(10-15)，较佳地为1:12。在另一优选例中，所述的钙黄绿素的摩尔浓度为1.0-1.5mmol/L，较佳地为1.25mmol/L。在另一优选例中，所述的Mn2+的摩尔浓度为10-20mmol/L，较佳地为15mmol/L。在另一优选例中，所述相溶溶剂为C2-C6的二元醇或多元醇。在另一优选例中，所述多元醇为甘油。在另一优选例中，所述甘油的含量为40％-60％，较佳地为45％-55％，更佳地为50％，按显色剂的总重量计。本专利技术的第二方面，提供了一种LAMP反应体系，所述的反应体系包含(A)本专利技术第一方面所述显色剂、(B)用于LAMP扩增的引物和酶、和(C)缓冲体系。在另一优选例中，所述的反应体系中所述显色剂的含量为3％-5％，较佳地为4％，按反应体系的总体积计。在另一优选例中，所述的反应体系中钙黄绿素的摩尔浓度为0.03-0.08mmol/L，较佳地为0.05mmol/L。在另一优选例中，所述的反应体系中Mn2+的摩尔浓度为0.3-0.8mmol/L，较佳地为0.6mmol/L。在另一优选例中，所述的酶为BstDNA聚合酶。在另一优选例中，所述的用于LAMP扩增的引物包含选自下组的引物：第一引物对：F3：GCTTTGTCCTTCGGGCATTA(SEQIDNO.:1)B3：GGTTTCGTAACGCCCAATGA(SEQIDNO.:2)第二引物对：FIP：ACGCAACTGCCAACGTGACATACTGGTCGGCTTGTTACTAGC(SEQIDNO.:3)BIP：TGGTAGACGATCCACCTGACCCCTCGCGCACATGTTAAACTC(SEQIDNO.:4)。在另一优选例中，所述的反应体系中第一引物对与第二引物对的摩尔浓度之比为1：(6-10)，较佳地为1：(7-9)，更佳地为1：8。在另一优选例中，所述的反应体系还包含待测DNA模板。在另一优选例中，所述的待测DNA模板为钉螺DNA粗提物。在另一优选例中，所述的待测DNA模板为1-50个钉螺的DNA粗提物。在另一优选例中，所述的缓冲液包含浓度为1.6M的甜菜碱(Betanine)、2.5M的dNTP、和0.8M的硫酸镁。本专利技术的第三方面，提供了一种LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含(A)本专利技术第一方面所述显色剂、和(B)用于LAMP扩增的引物和酶。在另一优选例中，所述试剂盒还包含(C)缓冲体系在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测钉螺体内感染血吸虫核酸的检测。在另一优选例中，所述的试剂盒还包含阳性对照DNA，所述阳性对照DNA是长度为250-350bp的28Sribsomal质粒DNA片段。在另一优选例中，所述的阳性对照DNA是长度为300bp的28Sribsomal质粒DNA片段。本专利技术的第四方面，提供了一种非诊断性非治疗性的检测钉螺体内感染血吸虫的方法，包括以下步骤：(i)提供一待测钉螺DNA样品；(ii)在本专利技术第一方面所述的显色剂存在下，对待测钉螺DNA样品进行LAMP扩增反应；(iii)观察反应体系的颜色变化，判断钉螺体内感染血吸虫的情况。在另一优选例中，步骤(iii)中，如果反应体系的颜色变为绿色，表示检测样品中含有血吸虫DNA；如果反应体系的颜色为棕黄色，表示检测样品中不含有血吸虫DNA。在另一优选例中，在步骤(iii)之前还包括对反应体系保温的步骤。在另一优选例中，步骤(iii)中，保温温度为60-65℃，较佳地为63-65℃。在另一优选例中，步骤(iii)中，保温时间为0.5-42h，较佳地为1-2h。本专利技术的第五方面，提供了一种本专利技术第一方面所述的显色剂的用途，所述显色剂用于制备一制剂，所述制剂用于血吸虫的检测。在另一优选例中，所述的制剂用于日本血吸虫的检测在另一优选例中，所述的制剂用于钉螺体内感染血吸虫的检测。在另一优选例中，所述的制剂用于钉螺体内感染血吸虫的核酸的检测。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了不同阳性钉螺、阴性钉螺混合比例的LAMP检测结果。图2显示了不同实验室采用本专利技术的LAMP检测试剂进行检测的结果。其中图2A显示了上海市疾病预防控制中心的检测结果，图2B显示了湖北省疾病预防控制中心寄生虫病所的检测结果，图2C显示了标准参考结果。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和摸索，首次意外地发现了一种检测钉螺体内感染血吸虫的核酸的反应体系及检测方法。实验表明，利用LAMP检测方法，通过调整显色剂中钙黄绿素和Mn2+的比例，可以显著提高检测的准确率，快速、简便的检测钉螺体内血吸虫感染情况。环介导等温扩增法环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的恒温核酸扩增结果，这种方法应用针对6个靶序列的4条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst)在等温条件下(60-65℃左右)保温1～2h，即可实现核酸的大量扩增,通过肉眼观察扩增产物颜色的变化即可判断样本中是否存在特异性DNA扩增片段。因其敏感、快速、不需特殊仪器设备的优点，自LAMP技术专利技术至今，LAMP方法已经广泛用于多种寄生虫病原体的检测。血吸虫血吸虫也称裂体吸虫(schistosoma)，是一种寄生在宿主静脉中的扁形动物。对人体危害较大的血吸虫有曼氏、埃及以及日本血吸虫。日本裂体吸虫(S.japonicum,即日本血吸虫)主要见于中国大陆、日本、台湾、印度尼西亚和菲律宾。日本血吸虫的生活史比较复杂，包括在终宿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种LAMP扩增显色剂，其特征在于，所述的显色剂包含(a)钙黄绿素(Calcein)、(b)Mn

【技术特征摘要】
1.一种LAMP扩增显色剂，其特征在于，所述的显色剂包含(a)钙黄绿素(Calcein)、(b)Mn2+、和(c)任选的相溶溶剂；并且所述钙黄绿素和Mn2+的摩尔浓度比为1:(10-15)，较佳地为1:12。2.如权利要求1所述的显色剂，其特征在于，所述的钙黄绿素的摩尔浓度为1.0-1.5mmol/L，较佳地为1.25mmol/L。3.如权利要求1所述的显色剂，其特征在于，所述的Mn2+的摩尔浓度为10-20mmol/L，较佳地为15mmol/L。4.一种LAMP反应体系，其特征在于，所述的反应体系包含(A)权利要求1所述显色剂、(B)用于LAMP扩增的引物和酶、和(C)缓冲体系。5.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述的反应体系中所述显色剂的含量为3％-5％，较佳地为4％，按反应体系的总体积计。6.如权利要求4所述的反应体系，其特征在于，所述的用于LAMP扩增的引物包含选自下组的引物：第一引物对：F3：GCTTTGTCCTTCGGGCATTA(SEQIDNO.:1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓农，秦志强，李石柱，许静，冯婷，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：上海,31