一种随机打断DNA的方法技术

本发明专利技术提供一种随机打断DNA的方法，其包括：在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。通过本发明专利技术的方法能够有效提高二代测序文库构建的效率。

A Method of Random Interruption of DNA

【技术实现步骤摘要】
一种随机打断DNA的方法
本专利技术涉及一种随机打断DNA的方法。
技术介绍
随着高通量测序(NGS)技术的发展与成熟，在科研、诊断、体检各市场领域应用范围不断扩大。除了市场的扩大之外，测序技术本身开发放慢速度，制约技术扩大应用的瓶颈渐渐显露出来。如今，样品制备在NGS中的瓶颈效应越来越明显，新试剂、新仪器不断涌现，以缩短时间，提高通量。同时，新方法也在不断开发，以处理更少的样本起始量等。目前，常用的染色体脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid，简称DNA)分子片段化方法主要有四种，分别为：DNA限制性酶切法，水动力剪切法，超声波断裂法，喷射雾化法，每种方法各有利弊。对长链DNA(通常指生物染色体DNA)片段化的主要原因是短的DNA片段有利于进行DNA分子快速杂交和高灵敏目标探测，另外在NGS文库构建的过程中，片段化是一个无法避开的过程。随着研究的不断深入，专注于DNA片段化技术的科研人员对更小、更快、更高效及低污染的实时检测体系的需求变得越来越大，因此针对DNA片段化技术的要求也越来越高。DNA分子双螺旋结构，是通过内侧氢键形成的碱基对使两条脱氧核苷酸长链稳固地并联起来，同时碱基对之间纵向的相互作用力也进一步提高了DNA分子的稳定性，所以DNA分子的双螺旋结构是一种相对稳定的结构。当前，寻找新型有效的DNA片段化技术是很有研究意义但是极具挑战性的课题。
技术实现思路
基于水动力剪切法，超声波断裂法的片段化方法，是Illumina官方最早推荐的DNA分子片段化方法。但相应的仪器配套的需求和限制，成为了该方法推广和提高通量的瓶颈。另外由于DNA分子的本身的特异性，例如甲基化修饰程度等，会提高分子本身的特性，使用机械方法这种区域会与其它区域有不同的断裂比例(几率)，这样一定程度上引入了机械打断的偏好性。近年，在NGS文库构建配套试剂盒的市场上陆续出现了新的非限制性内切酶处理的随机片段化方法，这大大降低了对仪器的依赖程度。但也具有一定的局限，主要体现在酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性上。例如，Illumina公司基于Tn5转座酶体现出的缺点是酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性；NEB公司基于T7Dna内切酶体现出的缺点是酶本身的稳定性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性；KAPA公司基于ShrimpDnase的体系体现出的缺点是提高了对样本纯度与对起始量的要求上。因此，鉴于上述情况，本专利技术要解决的问题，是使用更低成本的非限制性内切酶方法，摆脱打断仪器的限制，建立适用于普通分子生物学实验室和高通量NGS文库构建实验室的DNA打断方法。本专利技术主要涉及以下具体的方案：1.一种随机打断DNA的方法，其包括：在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。2.根据项1所述的方法，其中，所述二价阳离子为选自钙离子、镁离子中的一种或两种以上。3.根据项1或2所述的方法，其中，所述随机DNA双链结合蛋白质为sso7d蛋白质。4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，所述非离子表面活性剂为选自TritonX-100、Tween-20、Tween-80中的一种或两种以上。5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，所述一价盐中的金属离子为选自钠离子、钾离子中的一种或两种以上。6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，所述二价阳离子的使用浓度为0.01mM～2mM，优选为0.05mM～1mM，进一步优选为0.05mM～0.5mM。7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，所述随机DNA双链结合蛋白质的使用浓度为0ng/μL～6ng/μL，优选为3ng/μL～6ng/μL，进一步优选为4ng/μL～6ng/μL。8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，所述非离子表面活性剂的使用浓度为0.001％～1％，优选为0.005％～0.5％，进一步优选为0.01％～0.2％。9.根据项1～8中任一项所述的方法，其中，所述一价盐的使用浓度为0mM～500mM，优选为20mM～200mM。进一步优选为50mM～100mM。10.根据项1～9中任一项所述的方法，其中，在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，使用非限制性内切酶随机对DNA进行打断。11.根据项10所述的方法，其中，所述非限制性内切酶为选自DNAseI、不耐热虾DNAse、HL-dsDNase、dsDNase中的一种或两种以上。专利技术的效果通过采用上述本专利技术的方法，不需要使用价值昂贵的DNA打断仪，只使用普遍在分子生物学实验室都有的PCR仪等温浴设备就可以进行高效均一的片段化反应，处理时间短至10分钟左右，在节省成本的同时大大提高了处理通量。通过使用本专利技术的方法打断的DNA末端产物，不同于现有技术中的机械打断的方法产生的随机末端，通过本专利技术打断的DNA片段的5'端为磷酸基团，3'端为羟基，而现有技术中的方法无法实现对末端的控制，从而节省了在NGS文库构建中重新对单链末端进行修复的步骤，另外减少了高度甲基化的基因组区域的过分断裂丢失，提高了文库构建的效率(即成功率)。本专利技术的方法对纯化后的DNA分子结构不敏感，能够使用同样的操作条件高通量的处理不同物种、组织来源的样本，高效无偏好性地获得分子量范围比较窄的产物，完全满足下游NGS文库构建的需求。降低了样本准入的纯度标准。在片段化反应后，和片段化反应进行的同时，能够直接进行下游的NGS建库操作，不需要增加体系置换或DNA纯化分离的操作，终止反应只需要升高温度进行热灭活。进一步提高了整个文库构建过程的流畅程度。附图说明图1示出调整离子浓度降低位点偏好性。图2示出加入随机DNA双链结合蛋白降低位点偏好性。图3示出加入随机DNA双链结合蛋白后的目标区域的平均湿度。图4示出非离子型表面活性剂提高打断均一性的结果。图5示出增加一价盐浓度提高打断稳定性的结果。图6示出利用本专利技术的打断方法构建文库所得到的文库浓度。图7示出利用本专利技术的打断方法构建文库的未检出位点数。图8示出利用本专利技术的打断方法构建文库的重复无用的判读数。图9示出利用本专利技术的打断方法构建文库的捕获目标区域的覆盖度。图10示出利用本专利技术的打断方法构建文库的比对到基因组上的判读数。图11使用另一种内切酶HL-dsDNase打断后构建文库的caliper峰图。图12示出利用另一种一价盐KCL打断方法构建文库的calipe峰图。图13DnaseI文库caliper峰图。图14KAPA文库caliper峰图。具体实施方式非限制性内切酶处理的随机片段化方法，需要克服酶本身的稳定性、偏好性、对起始量的敏感性与后续建库步骤的兼容性上。在本专利技术中选择使用了一个来源广泛的非限制性内切酶，这样就不需要考虑位点本身分布的随机性问题，毕竟通常需要使用在来自于广泛物种来源的DNA上，这样的不同物种的限制性位点偏好性位点有着非常大的差异。另外不倾向于使用T7DNA内切酶这种以单链为底物的有热力学偏好的酶，会造成对DNA分子区域GC含量的偏好性。在本专利技术中，选择使用了有单双链活性的非限制性内切酶，例如可以列举但不限于：DNAseI、不耐热虾DNAse(thermolabile本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种随机打断DNA的方法，其包括：在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。

【技术特征摘要】
1.一种随机打断DNA的方法，其包括：在二价阳离子、随机DNA双链结合蛋白质、非离子表面活性剂以及一价盐的存在下，对DNA分子进行打断。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二价阳离子为选自钙离子、镁离子中的一种或两种以上。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述随机DNA双链结合蛋白质为sso7d蛋白质。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述非离子表面活性剂为选自TritonX-100、Tween-20、Tween-80中的一种或两种以上。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述一价盐中的金属离子为选自钠离子、钾离子中的一种或两种以上。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述二价阳离子的使用浓度为0.01mM～2mM，优选为0.05mM～1mM，进一步优选为0.05mM～0.5mM。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘伟业，程世月，王亚蕾，彭琼芳，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11