一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒，包括(1)样品采集与提取；(2)末端修复/磷酸化/加A；(3)添加含标签的接头序列；(4)捕获前扩增；(5)目的基因杂交捕获；(6)富集；(7)捕获后扩增。本发明专利技术基于二代数字分子标识符(DMI)和双链双标签双重纠错(DSDC)技术，可有效降低深度测序PCR扩增或测序中发生的错误，提高检测灵敏度，同时针对反应体系和杂交洗涤液进行了优化，能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求。可用于乳腺癌的靶向治疗、临床试验以及疗效评估涉及基因检测的技术领域。

A Library Construction Method and Kit for Multi-gene Detection of Breast Cancer

【技术实现步骤摘要】
一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，特别涉及一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒。
技术介绍
乳腺癌号称“女性癌症第一杀手”，99％发生在女性。全球肿瘤流行病统计数据显示乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，而乳腺癌的发病率，居女性所有癌种发病率之首，且近几年一直居高不下，中国的发病率每年以3％的速度增长，高出发达国家1-2个百分点，发病率的增速是全球平均增速的两倍，在全世界排第一，每年新增病例超过50万，死亡人数超过4万。ctDNA作为乳腺癌患者的特异性肿瘤分子标志物，已在多篇文献中报道，不但可以用于肿瘤进化动态监测，疗效评估，还可以用于靶向治疗和个性化复发风险、预后评估。目前市场上主要只针对基因的编码区(coding-region)进行检测，并且所检测基因种类不齐全。在中国，乳腺癌的合成致死疗法还未开始被运用，什么是合成致死？当细胞的基因A功能异常的时候，细胞还可以存活，当细胞的基因B功能异常的时候，细胞也可以存活，但这两个基因同时功能异常的时候，就会发生致死效应。HRD相关基因检测是PARP抑制剂利用合成致死治疗癌症的生物标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品采集与提取：收集外周血，分离血浆，并提取游离核酸DNA；(2)末端修复/磷酸化/加A：对提取到的游离核酸DNA进行末端修复、磷酸化及加A；(3)添加含标签的接头序列：将步骤(2)处理后的游离核酸DNA与含标签的接头序列混合，PCR反应，纯化后得标签‑靶标DNA；(4)捕获前扩增：对标签‑靶标DNA进行PCR扩增，然后进行纯化，获得基因组DNA文库；(5)目的基因杂交捕获：使用Hyb Block将基因组DNA文库进行杂交前的封闭，然后使用捕获探针与基因组DNA文库进行杂交捕获；(6)富集：对步骤(5)捕获到的靶序列采...

【技术特征摘要】
1.一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品采集与提取：收集外周血，分离血浆，并提取游离核酸DNA；(2)末端修复/磷酸化/加A：对提取到的游离核酸DNA进行末端修复、磷酸化及加A；(3)添加含标签的接头序列：将步骤(2)处理后的游离核酸DNA与含标签的接头序列混合，PCR反应，纯化后得标签-靶标DNA；(4)捕获前扩增：对标签-靶标DNA进行PCR扩增，然后进行纯化，获得基因组DNA文库；(5)目的基因杂交捕获：使用HybBlock将基因组DNA文库进行杂交前的封闭，然后使用捕获探针与基因组DNA文库进行杂交捕获；(6)富集：对步骤(5)捕获到的靶序列采用磁珠富集法进行富集；(7)捕获后扩增：对步骤(6)富集后的靶序列进行PCR扩增，纯化后获得目的基因文库。2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：含标签的接头序列为：正链：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCNNNNNNNNNNNNGATCT；负链：/5phos/GATCNNNNNNNNNNNNGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；其中，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T；负链中的标签序列与正链中的标签序列反向互补。3.根据权利要求2所述的文库构建方法，其特征在于：正链中的标签序列具体包括SEQIDNo.1—SEQIDNo.25所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(4)捕获前扩增的PCR扩增引物序列如下：上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAG下游引物：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC。5.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：所述HybBlock的序列为：SEQIDNo.26和SEQIDNo.27。6.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(5)中，用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液组成为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，5～8％硫酸葡萄糖，无核酸酶水余量。7.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(5)的捕获探针经生物素标记，步骤(6)中磁珠富集法的磁珠为链霉亲和素偶联的磁珠，磁珠富集法采用的清洗液包括清洗液I和清洗液II，清洗液I组分为：0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，1％氯化镁，无核酸酶水余量；清洗液II组分为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，无核酸酶水余量。8.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(7)捕获后扩增的PCR扩增引物如下：通用引物P1：AATGATACGGCGACCACCGAG和Index引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC，NNNNNNNNNNNN是长度为3～15nt的标签序列，N为A、G、C或T。9.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，乳腺癌多基因检测的被检测基因包括：第一组、乳腺癌基因非编码区相关基因：CTNNB1、TERT、ZNF143、LEPROTL1、RMRP、NEAT1、TBC1D12、FOXA1、ALDOA；第二组、乳腺癌基因编码区与同源重组修复缺陷相关基因:BRCA1、BRCA2、EMSY、PTEN、RAD51C、RAD51D、RAD50、ATM、ATR、FANC、B...

【专利技术属性】
技术研发人员：童云广，王瓯晨，徐鹭芹，
申请(专利权)人：奥明杭州基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33