活性型突变酶的制造方法及新型活性型突变酶、以及可溶性化突变蛋白的制造方法技术

本发明专利技术提供一种包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法的方法，其为使在异源表达系统中不作为活性型酶或可溶性蛋白表达或者即便活性型酶表达也很微量的酶作为活性型突变酶或可溶性蛋白进行表达的方法。此外还提供通过该手法获得的新型的活性型突变酶。本发明专利技术涉及活性型突变酶或可溶性化突变蛋白的制造方法，其为对失活型酶或不溶性蛋白进行特定，对失活型酶或不溶性蛋白的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸、存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定，制备对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸、存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行替换而成的氨基酸序列进行编码的基因，或者对失活型酶的氨基酸序列中的序列同源性的保守性相对低的氨基酸进行特定，制备将该氨基酸用保守性比该氨基酸高的氨基酸进行替换而成的氨基酸序列进行编码的基因，在异源表达系统中使该基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择活性型突变酶或可溶性化突变蛋白。

Method for producing active mutant enzyme, novel active mutant enzyme and method for producing soluble mutant protein

The present invention provides a method of effectively containing the selected mutations into the position and the amino acid mutation technique, which is made in a heterologous expression system is not as active enzyme or soluble protein expression or even active enzyme expression is the enzyme activity as a method of trace mutant enzyme or soluble protein expression. In addition, a novel active mutant enzyme obtained by this technique is also provided. The invention relates to a method for manufacturing activated mutant enzyme or of soluble mutant protein, the inactivation of enzyme or insoluble protein was specific, hydrophobic amino acid, hydrophilic region inactivating enzymes or insoluble protein exists in the alpha helix part exists in the hydrophobic region of the hydrophilic specific amino acids, preparation of hydrophobic amino acids, found in hydrophilic regions exist in the hydrophobic region of the hydrophilic amino acid amino acid sequence substitution and genes encoding the amino acid sequence or inactivating enzymes in the sequence of specific amino acids of the conserved relatively low homology system the preparation of amino acids of the amino acids with high conservative amino acid sequence substitution and genes encoding the gene expression in heterologous expression system, protein The active mutant enzyme or the soluble mutant protein was selected from the obtained protein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】活性型突变酶的制造方法及新型活性型突变酶、以及可溶性化突变蛋白的制造方法
本专利技术涉及活性型突变酶的制造方法及新型的活性型突变酶以及可溶性化突变蛋白的制造方法。更详细地说，本专利技术涉及通过在异源表达系统中作为失活型酶表达的酶中导入突变、获得活性型突变酶的方法，该方法为包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法的方法，以及通过该方法获得的新型的活性型突变酶。此外，本专利技术还涉及通过在异源表达系统中作为不溶性型蛋白表达的蛋白中导入突变、获得可溶性化突变蛋白的方法，其包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法。相关申请的相互参照本申请主张2015年6月10日申请的日本特愿2015-117808号的优先权，其全部记载特别是作为公开内容援引在此。
技术介绍
在异源表达系统中使酶蛋白基因表达时，蛋白多不作为活性型酶表达，这成为利用异源宿主进行酶蛋白的大量表达中的最大问题。为了解决该问题，一直以来进行了各种尝试。例如，作为以大肠杆菌为宿主使其作为活性型酶进行表达的手法，研究了菌体培养条件(专利文献1)；与通过共表达的分子伴侣形成正确的立体结构的伴侣进行共表达的方法(专利文献2)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活性型突变酶的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、选择具有与天然型中得到的活性为同种酶活性的蛋白即活性型突变酶，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白即失活型酶的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.10 JP 2015-1178081.一种活性型突变酶的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、选择具有与天然型中得到的活性为同种酶活性的蛋白即活性型突变酶，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白即失活型酶的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸。2.根据权利要求1所述的制造方法，其包含以下工序：(1)对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白即失活型酶进行特定的工序；(2a)对所述(1)工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分进行特定，对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的工序；(3a)制备具有对下述氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序，所述氨基酸序列是如下而成的：对所述失活型酶的氨基酸序列内的存在于所述α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸；(4a)在异源表达系统中使具有所述(3a)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白即活性型突变酶的工序。3.一种可溶性化突变蛋白的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、选择经可溶性化的蛋白即可溶性化突变蛋白，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为可溶性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时在表达系统内变为不溶性的蛋白即不溶性型蛋白的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸。4.根据权利要求3所述的方法，其包含以下工序：(1)对天然型时为可溶性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白即不溶性型蛋白进行特定的工序；(2a)对所述(1)工序中特定的不溶性型蛋白的α螺旋结构部分进行特定，对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的工序；(3a)制备具有对下述氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序，所述氨基酸序列是如下而成的：对所述不溶性型蛋白的氨基酸序列内的存在于所述α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸；(4a)在异源表达系统中使具有所述(3a)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择经可溶性化的蛋白即可溶性化突变蛋白的工序。5.根据权利要求3或4所述的制造方法，其中，根据异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量判断是否为可溶性化突变蛋白。6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，将异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量比天然型蛋白的异源表达后的提取液中的所述可溶性蛋白量大的突变蛋白定义为可溶性化突变蛋白。7.根据权利要求2或4所述的制造方法，其中，所述工序(2a)中的亲水性区域和/或疏水性区域的特定如下进行：使用二级结构预测法对α螺旋结构部分的螺旋轮进行作图，将螺旋轮上的氨基酸按照1位、5位、2位、6位、3位、7位、4位的顺序排列形成一列，重复该操作至少形成2列每列由7个氨基酸构成的氨基酸序列，其中，第2列的氨基酸数量为5以上即可，在至少排列了2列的氨基酸序列区域中，将各行氨基酸的总亲水指数为0以上的行定义为疏水性行、将小于0的行定义为亲水性行，将3个或4个疏水性行连续而成的束定义为疏水性区域，将4个或3个亲水性行连续而成的束定义为亲水性区域，其中，疏水性区域中的4个疏水性行内侧的任一行的总亲水指数可以小于0、亲水性区域中的4个亲水性行内侧的任一行的总亲水指数可以为0以上。8.根据权利要求2、4或7所述的制造方法，其中，所述工序(2a)中，将存在于亲水性区域的氨基酸内的亲水指数为0以上的氨基酸特定为疏水性氨基酸，将存在于疏水性区域的氨基酸内的亲水指数小于0的氨基酸特定为亲水性氨基酸。9.根据权利要求2、4、7～8中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中，将存在于亲水性区域的疏水性氨基酸替换成亲水指数比替换对象的氨基酸小的氨基酸，将存在于疏水性区域的亲水性氨基酸替换成亲水指数比替换对象的氨基酸大的氨基酸。10.根据权利要求2、4或7所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中，将存在于亲水性区域的疏水性氨基酸替换成亲水指数比替换对象的氨基酸小且亲水指数的值小于0的氨基酸，将存在于疏水性区域的亲水性氨基酸替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸大且亲水指数的值为0以上的氨基酸。11.根据权利要求2、4、7～10中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中的氨基酸的替换为替换成与替换对象的氨基酸相比，序列同源性的保守性更高的氨基酸。12.根据权利要求2、4、7～11中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：浅野泰久，松井大亮，奥祐子，
申请(专利权)人：公立大学法人富山县立大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP