一种新型(R)‑羟基腈裂合酶制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种比植物来源的羟基腈裂合酶稳定性更高、使用其基因可以异源表达的羟基腈裂合酶，编码该羟基腈裂合酶的基因以及该羟基腈裂合酶的制备方法。本发明专利技术涉及的羟基腈裂合酶，其特征在于，该羟基腈裂合酶具有序列编号3的氨基酸序列等特定的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种比植物来源的羟基腈裂合酶稳定性更高，并且也可以使用其基因异源表达的(R)-羟基腈裂合酶，编码该羟基腈裂合酶的基因，以及该羟基腈裂合酶的制备方法。
技术介绍
羟基腈裂合酶是催化在氰化物供体的存在下将羰基化合物转换为氰醇(α-羟基腈)的反应的酶。氰醇由于可转换为α-羟基酸、α-羟基酮、β-氨基醇等各种化合物，是医药领域和化学品领域等的重要中间体。因而，期待开发可以大量生产羟基腈裂合酶的方法。羟基腈裂合酶分为(S)选择性和(R)选择性两种。其中，(R)-羟基腈裂合酶催化在酸性条件下由酮或醛与氰化合物生成(R)-氰醇的反应。作为该反应的代表例，可以为由苯甲醛和作为氰化合物的氰酸生成(R)-苯乙醇腈的反应。此外，(R)-羟基腈裂合酶可以用作由低价的底物生产作为医药和化学制品中间体利用价值高的光学活性体的生物催化剂，在多个领域中极其有用。为了在光学活性氰醇的工业生产中利用羟基腈裂合酶，期待开发可大量生产每个菌体或每个蛋白质的活性高的立体选择性高的羟基腈裂合酶的方法。羟基腈裂合酶公知主要在具有氰苷的植物中存在。例如，作为(R)-羟基腈裂合酶可知来源于扁桃(Prunus amygdalus)等的蔷薇科植物。此外，作为(S)-羟基腈裂合酶可知来源于高粱(Sorghum bicolor)等的稻科植物，或木薯(Manihot esculenta)、橡胶树(Hevea brasiliensis)、薇籽(Baliospermum)等的大戟科植物。但是，仅能从以上的植物体中提取微量的羟基腈裂合酶。因此，为了大量得到羟基腈裂合酶，尝试通过基因工程方法得到羟基腈裂合酶(专利文献1-9)。然而，使用转化株表达异源蛋白质时，存在不能直接应用根据同源蛋白质的研究得到的表达量和生化活性等的结果的情况。即，使用转化株表达异源蛋白质时，不能容易地预先预测转化株的行为、表达量、目标蛋白质的生化活性等。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表平11-508775号公报专利文献2：日本特开2000-189159号公报专利文献3：日本特开2000-189160号公报专利文献4：日本特开2000-245486号公报专利文献5：日本特开2002-330791号公报专利文献6：国际公开第01/48178号小册子专利文献7：日本特开2004-194550号公报专利文献8：日本特开2004-194551号公报专利文献9：日本特开2000-125886号公报
技术实现思路
如上述，羟基腈裂合酶是在产业上非常重要的酶，工业上的利用也需要稳定供给。但是，将在具有氰苷的植物中发现的羟基腈裂合酶从植物体中精制时，只能得到少量。另一方面，羟基腈裂合酶存在难以异源表达的问题。此外，用羟基腈裂合酶生产光学活性化合物时，酶需要暴露在苛刻的条件下，因此期待得到稳定性高的酶。由此本专利技术的目的在于提供一种比植物来源的羟基腈裂合酶稳定性更高并且也可以使用其基因异源表达的(R)-羟基腈裂合酶，编码该羟基腈裂合酶的基因，以及该羟基腈裂合酶的制备方法。本专利技术的专利技术人为了解决上述问题进行了深入研究。其结果发现，在特定的区域周期性大量出现的马陆(ヤンバルトサカヤスデ)产生的(R)-羟基腈裂合酶具有极好的稳定性，从而完成了本专利技术。[1]具有下述(1)-(3)中的任意一项的氨基酸序列的(R)-羟基腈裂合酶。(1)序列编号3所示的氨基酸序列；(2)上述(1)中规定的氨基酸序列中，1个或数个的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列；(3)与上述(1)中规定的氨基酸序列具有至少30％的同源性的氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列。[2]上述[1]所述的(R)-羟基腈裂合酶，该(R)-羟基腈裂合酶为具有上述(1)-(3)中的任意一项的氨基酸序列的亚基的二聚体。[3]上述[1]或[2]所述的(R)-羟基腈裂合酶，该(R)-羟基腈裂合酶为马陆属(Chamberlinius)来源。[4]上述[3]所述的(R)-羟基腈裂合酶，该(R)-羟基腈裂合酶为马陆(Chamberlinius hualienensis)来源。[5]具有下述(4)-(6)中任意一项的碱基序列的(R)-羟基腈裂合酶基因。(4)序列编号2所示的碱基序列；(5)上述(4)中规定的碱基序列中，1个或数个的碱基缺失、替换和/或插入的碱基序列，并且与序列编号2所示的碱基序列编码的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，该碱基序列编码的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的碱基序列；(6)与上述(4)中规定的碱基序列具有至少30％的同源性的碱基序列，并且与序列编号2所示的碱基序列编码的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，该碱基序列编码的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的碱基序列。[6]上述[5]所述的(R)-羟基腈裂合酶基因，该(R)-羟基腈裂合酶基因具有序列编号1所示的碱基序列。[7]一种载体，其特征在于，该载体含有上述[5]或[6]所述的(R)-羟基腈裂合酶基因。[8]一种转化株，其特征在于，该转化株为通过上述[7]所述的载体转化的转化株。[9]一种用于制备(R)-羟基腈裂合酶的方法，其特征在于，该方法包括，培养上述[8]所述的转化株得到培养物的工序，以及从上述培养物中精制(R)-羟基腈裂合酶的工序。本专利技术的(R)-羟基腈裂合酶在马陆个体中含有，但其含量很少。但是，由于马陆周期性在局部地区大量出现，精制酶的原材料可以比较大量且容易地得到。即，本专利技术的(R)-羟基腈裂合酶的精制的困难度，能够通过作为原材料的马陆的量克服。此外，本专利技术的(R)-羟基腈裂合酶稳定性良好，例如，能够适用于作为重要合成中间体的氰醇的制备。从而本专利技术的(R)-羟基腈裂合酶在产业上非常有用。附图说明图1是分离了本专利技术的酶的马陆(Chamberlinius hualienensis)的照片。(A)为捕获时比较大型的马陆的照片，(B)为比较小型的马陆的放大照片。图2是示出将从马陆精制的(R)-羟基腈裂合酶用SDS-PAGE分析的结果的凝胶的照片。(A)是使用分子量标记物求出分子质量的凝胶的照片，(B)是为了确认糖链的有无而进行了染色的凝胶的照片。图3(A)-(C)分别为从马陆精制的(R)-羟基腈裂合酶的紫外·可见·近红外光谱、红外光谱以及圆二色谱的测定结果。图4示出从马陆精制的(R)-羟基腈裂合酶的cDNA、推定氨基酸序列以及引物的退火位点。图5(A)和(B)分别为示出从马陆精制的(R)-羟基腈裂合酶的反应pH与比活和残余活性的关系的图表。图6(A)和(B)分别为示出从马陆精制的(R)-羟基腈裂合酶的反应温度与比活和残余活性的关系的图表。图7(A)和(B)分别为示出从马陆精制的(R)-羟基腈裂合酶与重组(R)-羟基腈裂合酶的反应pH、反应温度以及比活与残余活性的关系的图表。具体实施方式以下，首先对本专利技术涉及的(R)-羟基腈裂合酶进行说明。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种(R)‑羟基腈裂合酶，其中，该(R)‑羟基腈裂合酶具有下述(1)‑(3)中的任意一项的氨基酸序列；(1)序列编号3所示的氨基酸序列；(2)上述(1)中规定的氨基酸序列中，1个或数个的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)‑羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的(R)‑羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列；(3)与上述(1)中规定的氨基酸序列具有至少30％的同源性的氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)‑羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的(R)‑羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.04 JP 2014-0421811.一种(R)-羟基腈裂合酶，其中，该(R)-羟基腈裂合酶具有下述(1)-(3)中的任意一项的氨基酸序列；(1)序列编号3所示的氨基酸序列；(2)上述(1)中规定的氨基酸序列中，1个或数个的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列；(3)与上述(1)中规定的氨基酸序列具有至少30％的同源性的氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的(R)-羟基腈裂合酶，其中，所述(R)-羟基腈裂合酶为具有上述(1)-(3)中的任意一项的氨基酸序列的亚基的二聚体。3.根据权利要求1或2所述的(R)-羟基腈裂合酶，其中，所述(R)-羟基腈裂合酶为马陆属(Chamberlinius)来源。4.根据权利要求3所述的(R)-羟基腈裂合酶，其中，所述(R)-羟基腈裂合酶为马陆(Chambe...

【专利技术属性】
技术研发人员：浅野泰久，M·D·拉克莫萨利，石田裕幸，
申请(专利权)人：公立大学法人富山县立大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP